2型豬鏈球菌的毒力因子的鑒定及分布

徐引弟，王治方，張青嫻，朱文豪，焦文強(qiáng)，李海利，郎利敏，王克領(lǐng)

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州450002）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，S.suis）是一種重要的細(xì)菌性豬病病原，給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。當(dāng)感染S.suis后，病豬通常會(huì)出現(xiàn)腦膜炎、關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎以及敗血癥等癥狀，嚴(yán)重時(shí)常引起病豬死亡[1-4]。根據(jù)鏈球菌莢膜多糖抗原性的不同，可分為35個(gè)血清型（1～34型和 1/2 型），其中豬鏈球菌血清型 2 型（Streptococcus suis serotype2，SS2）在世界范圍內(nèi)被廣泛報(bào)道為最主要的致病性血清型。國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為豬鏈球菌的致病性與其毒力因子有密切關(guān)系，目前研究較多的豬鏈球菌主要毒力因子有莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、溶菌酶釋放蛋白（muramidase-released protein，MRP）、胞外因子（extracellular protein fateror，EPF）和溶血素（suilysin，SLY）。莢膜多糖的成分和結(jié)構(gòu)與細(xì)菌的病原性和血清型有關(guān)，是致病性分離株所必需的組分。溶菌酶釋放蛋白分子質(zhì)量為136 kDa，是豬鏈球菌細(xì)胞壁上的大分子糖蛋白。溶菌酶釋放蛋白單獨(dú)足以破壞大腦的血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障。溶血素通過(guò)對(duì)機(jī)體血小板和淋巴細(xì)胞的損傷來(lái)破壞機(jī)體的凝血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，溶血素陽(yáng)性的鏈球菌可以破壞脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞，從而突破腦脊液屏障，出現(xiàn)腦膜炎癥狀[5-8]。鏈球菌的毒力是由多種毒力因子協(xié)同作用的，對(duì)毒力因子的深入研究將有助于探究豬鏈球菌的致病機(jī)理，建立快速準(zhǔn)確的診斷鑒定方法，對(duì)疫苗的研發(fā)也有著重要意義。

豬鏈球菌病已給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，特別是高致病力的2型豬鏈球菌已在豬群中廣泛流行并嚴(yán)重致病，并且具有極為重要的的公共衛(wèi)生學(xué)意義。為此，本試驗(yàn)擬對(duì)河南省規(guī)?；i場(chǎng)2型豬鏈球菌的毒力及毒力基因等特性進(jìn)行研究，為預(yù)防和控制該病的流行提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株2016年1月～2016年12月分離自河南省養(yǎng)豬場(chǎng)發(fā)生呼吸困難、敗血癥、關(guān)節(jié)炎及神經(jīng)癥狀的發(fā)病及死亡豬的腦、肺臟、氣管、心血、關(guān)節(jié)液等的鏈球菌共189株，其中2型豬鏈球菌87株。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 TSA（Tryptic Soy Agar，胰蛋白大豆瓊脂）和TSB（Tryptic Soy broth，胰蛋白大豆肉湯）購(gòu)自Difco公司；綿羊全血平皿、革蘭氏染色液購(gòu)自鄭州理利生物公司；胎牛血清自制。柱式DNA抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；2×TaqMix、DL2000 DNA Marker購(gòu)自寶生物（大連）有限公司；小鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 豬鏈球菌培養(yǎng)基配制TSB液體培養(yǎng)基：含TSB肉湯粉30 g，溶于1000 mL超純水中，115℃滅菌15 min，加胎牛血清50 mL；TSA固體培養(yǎng)基：含TSA瓊脂粉4 g，溶于100 mL超純水中，115℃滅菌15 min，冷卻至45℃加胎牛血清5 mL，傾倒平皿；于4℃保存?zhèn)溆?。血平皿：TSA固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至45℃加脫纖綿羊血5 mL。

1.4 毒力試驗(yàn)將分離鑒定好的2型豬鏈球菌接種含血清的TSB培養(yǎng)基，37℃ 250 r/min振搖培養(yǎng)24 h。用生理鹽水稀釋菌數(shù)約為109CFU/mL，腹腔注射小白鼠0.2 mL；同時(shí)設(shè)生理鹽水陰性對(duì)照。接種后觀察發(fā)病及死亡情況，剖檢小白鼠，無(wú)菌取其心血分離細(xì)菌并鑒定。

1.5 引物設(shè)計(jì)豬鏈球菌gdh基因和2型豬鏈球菌cps基因引物參考文獻(xiàn)[9]。根據(jù)豬鏈球菌胞外因子（epf）基因的序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，用于豬鏈球菌胞外因子（epf）基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為626 bp。epf1：5'-GCTACGACGGCCTCAGAAATC-3'，epf2：5'-TGGATCAACCACTGGTGTTAC-3'。根據(jù)豬鏈球菌溶菌酶釋放蛋白（mrp）基因的序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，用于豬鏈球溶菌酶釋放蛋白（mrp）基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為885 bp。mrp1：5'-ATCAGAATCACCACTTTTGG-3'，mrp2：5'-TCA TACCCA GTAAATACACG-3'。根據(jù)豬鏈球菌溶血素（sly）基因的序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，用于豬鏈球溶血素（sly）基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為1502 bp。sly1：5'-ATGAGAAAAAG TTCGCACTTGATT-3'，sly2：5'-TT GCCAGATTA CTCTATCA-3'。

1.6 毒力因子鑒定2型豬鏈球菌DNA提?。河媒臃N環(huán)取純化后對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌菌落放入裝有50 uL純水的ep管中，按照DNA提取試劑盒上的步驟操作，提取的DNA保存于－80℃?zhèn)溆?。反?yīng)體系（25 μL）：2×TaqMix 12.5 μL， 10 μmol/L通用引物SS1、SS2各1 μL，模板（按照DNA提取試劑盒的操作步驟提取出的DNA）1 μL，加ddH2O 至25 μL。鏈球菌2型，epf基因、mrp基因、sly基因的擴(kuò)增體系同豬鏈球菌。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。取10 uL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，紫外光下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 毒力試驗(yàn)所有分離鑒定的2型豬鏈球菌接種小鼠后，小鼠24 h內(nèi)死亡。取死亡鼠心血接種綿羊全血平皿進(jìn)行分離培養(yǎng)。結(jié)果顯示，分離出的細(xì)菌與2型豬鏈球菌特性一致。因此，證明該分離菌為豬2型鏈球菌。

2.2 毒力因子鑒定用豬鏈球菌epf基因、mrp基因、sly基因引物擴(kuò)增，結(jié)果分別擴(kuò)增出626、885和1502 bp大小片段，并經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，他們與豬鏈球菌SS2-1株（GenBank登錄號(hào)：CP018908）基因相應(yīng)片段的同源性為100%。

圖1 PCR鑒定毒力因子結(jié)果Fig.1 PCR results of virulence factors

2.3 毒力因子的分布將鑒定好的87株2型豬鏈球菌進(jìn)行mrp、sly、epf的擴(kuò)增，結(jié)果共有8種基因型?；蛐蛃ly+mrp+epf+的有47株，占54.02%；sly+mrpepf+的有15株，占17.24%；sly-mrp+epf+的有7株，占8.04%；sly-mrp-epf-的有6株，占6.90%；slymrp+epf-的有5株，占5.75%；sly+mrp-epf-的有3株，占3.44%；sly+mrp+epf-的有2株，占2.29%；sly-mrpepf+的有2株，占2.29%。以上結(jié)果表明，河南省流行的2型豬鏈主要以毒力相對(duì)高的sly+mrp+epf+型為主，其次為sly+mrp-epf+型和sly-mrp+epf+型。

3 討論

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病的病原，引起豬的敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎，是當(dāng)今豬場(chǎng)最主要的細(xì)菌性疫病之一。其中豬鏈球菌血清型 2 型是最主要的致病性血清型。在筆者和其他的報(bào)道中均有報(bào)道，占總分離的鏈球菌的10%～45%不等[10-13]。本試驗(yàn)中2016年分離的87株2型豬鏈球菌占總分離鏈球菌的46%，因此可見，高致病力的2型豬鏈球菌已在豬群中廣泛流行并嚴(yán)重致病。

豬鏈球菌的致病性與其毒力因子有密切關(guān)系，目前研究較多的豬鏈球菌主要毒力因子有莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、溶菌酶釋放蛋白（muramidase-released protein，MRP）、胞外因子（extracellular protein fateror，EPF）和溶血素（suilysin，SLY）。因此本試驗(yàn)對(duì)分離的2型豬鏈球菌進(jìn)行了cps、mrp、epf、sly毒力基因的檢測(cè)，結(jié)果表明河南省流行的2型豬鏈球菌的主要以毒力相對(duì)高的sly+mrp+epf+菌株為主，這與其他的報(bào)道是一致的[14-20]。通過(guò)對(duì)豬鏈球菌的毒力及毒力基因進(jìn)行研究，可為河南省豬鏈球菌病的基礎(chǔ)研究及預(yù)防、控制與診斷提供一定的理論依據(jù)。