大鼠細(xì)小病毒VP2原核表達(dá)及間接ELISA方法建立

霍 娜，姚 威，于婉琪，魏曉鋒，蕭 颯, 陳鴻軍

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌 712100；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 2012033）

大鼠細(xì)小病毒（Rat parvovirus，RPV）是對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠危害最為嚴(yán)重的病毒之一，屬單股線狀無囊膜DNA病毒，分類上屬細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，包括Kilham大鼠病毒（Kilham rae parvovirus，KRV），Toolan病毒（Toolans H-1 virus），大鼠細(xì)小病毒a型（RPV-1a）和大鼠微小病毒（Rat minute virus，RMV）4種毒株[1,2]。RPV在實(shí)驗(yàn)大鼠和野生大鼠中有較高的感染率，無任何臨床癥狀和病理變化，但在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)性感染，并可致種鼠群繁殖率下降，污染腫瘤移植物和細(xì)胞系，對(duì)實(shí)驗(yàn)研究造成嚴(yán)重干擾，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)標(biāo)中SPF級(jí)大鼠病毒必檢項(xiàng)目之一[2-4]。

RPV的VP蛋白是結(jié)構(gòu)性或衣殼蛋白，包括VP1、VP2和VP3。VP1是次要衣殼蛋白，其編碼序列包含特殊的N端殘基和VP2蛋白。而VP2是主要的衣殼蛋白，參與衣殼組裝，釋放大約85%的病毒粒子。VP2蛋白還決定了人腫瘤細(xì)胞對(duì)于H-1毒株的易感性。VP3蛋白是VP2的裂解產(chǎn)物[5-7]。

為檢測(cè)大鼠細(xì)小病毒、大鼠微小病毒和細(xì)小病毒NS-1株感染的抗體水平，本研究參考這3種病原基因組DNA序列，設(shè)計(jì)引物，克隆大鼠細(xì)小病毒VP2抗原的特異性表位，原核表達(dá)后，以純化蛋白為包被抗原，建立間接ELISA方法，可有效地用于大鼠細(xì)小病毒血清抗體檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑表達(dá)載體pET30a、大腸桿菌BL21（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存。Balb/c小鼠購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 血清和試劑大鼠細(xì)小病毒RPV、H-1和KRV毒株陽性血清和待檢血清由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。RPV VP2小鼠單克隆抗體2E7由本實(shí)驗(yàn)自制。HRP標(biāo)記羊抗大鼠IgG（H+L）購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；Phanta?Max Super-Fidelity DNA聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物公司，T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI均購(gòu)自英國(guó)NEB公司，其他試劑均為分析純。

1.3 VP2基因克隆及原核表達(dá)

1.3.1 基因分析與引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI發(fā)表的大鼠細(xì)小病毒RPV（GenBank登錄號(hào)：ACV32720）、H-1株（GenBank登錄號(hào)：AFR44451.1）、KRV株（GenBank登錄號(hào)：AAB38328.1）、RMV（GenBank登錄號(hào)：AGG38825）和MVM株（GenBank登錄號(hào)：ABB01355.1）的VP2蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出了一段特異的378 bp片段編碼RPV-VP2的成熟肽：5'-ATGGCTGCTAGA GTTGAGAGAGCAGCTGACGGCAGTGGAGGC TCTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTAATGGTG GTGTTGGGGTTTCTACGGGGAGCTTTGATAA CCAAACGCACTATGACTTCCTTGGAGGGGGG TGGGTCCGTATCACAGCGTATGCTTCGCGAC TTGTTCATATAAATATGCCTGCTTCTGAAGA GTACCATAGAATTTTTGTTAGAAATAATACT GATACTGGTCAAAAGGGAAAGATGTCTTTG GATGATGTGCACACACAGATCTGGACTCCAT GGAGTCTGGTAGATGCTAATGCATGGGGCT GTTGGTTTCAGCCAAGTGACTGGCAGTTTAT TCAAAACTCTATGGCTGAACTTAATCTT-3'。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物序列：5'-CGCGGATCC ATGGCTGCTAGAGTTGAGAGAG-3'，下游引物：5'-GCCCTCGAG TCAAAGATT AAGTTCAGCCATAG -3'，下劃線分別為BamH I和XhoI位點(diǎn)，斜體部分為保護(hù)性堿基。

1.3.2 VP2基因的擴(kuò)增與克隆 以合成的基因?yàn)槟０澹禺愋砸飻U(kuò)增VP2基因，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR反應(yīng)產(chǎn)物。純化后與pET30a載體連接，酶切鑒定正確后命名pET30a-VP2，重組質(zhì)粒送至蘇州金唯智公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化鑒定 將測(cè)序正確的pET30a-VP2重組質(zhì)粒接種于Kan+抗性培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD值達(dá)為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)約8 h。同時(shí)設(shè)pET30a載體為空白對(duì)照。于4℃離心收集細(xì)菌培養(yǎng)物，進(jìn)行15% SDS-PAGE鑒定。確認(rèn)表達(dá)后利用Ni-瓊脂糖凝膠6FF(His標(biāo)簽純化樹脂）對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化, 具體方法按說明書進(jìn)行。純化后產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡分析，用本實(shí)驗(yàn)室制備的VP2單克隆抗體作為一抗，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用ECL發(fā)光液顯色。

1.4 小鼠陽性血清的制備純化后的VP2蛋白與等體積完全弗氏佐劑混合并完全乳化，腹腔注射，50 μg/只免疫6周齡的Balb/c小鼠；7 d后二免，免疫途徑、劑量同一免，用弗氏不完全佐劑；14 d后三免，不加佐劑，腹腔注射，50 ug/只。5 d后收集血清測(cè)抗體效價(jià)。

1.5 間接ELISA方法的建立

1.5.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定 采用方陣滴定法將純化的VP2重組蛋白用pH9.6的碳酸鹽緩沖液按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000、1∶2000、1∶4000的梯度稀釋，每個(gè)稀釋度包被一豎行，100 μL/孔，4℃包被過夜；次日棄液，TBST洗滌3次，5 min/次，甩干；5%脫脂奶粉37℃封閉2 h；棄脫脂奶，洗滌同上，甩干；小鼠陰陽性血清分別按照1∶200、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16 000的梯度稀釋，每個(gè)稀釋度加一橫行，100 μL/孔，37℃孵育60 min；洗板同上，甩干；加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗（1:5000），100 μL/孔，37℃孵育45 min；洗板同上，甩干；加入100 μL/孔TMB顯色液，室溫避光顯色15 min；最后加入50 μL/孔2 mol/L H2SO4終止顯色；酶標(biāo)儀測(cè)定OD450。以P/N值最大的稀釋度為抗原與血清的最佳稀釋度。

1.5.2 臨界值的確定 將經(jīng)進(jìn)口全病毒間接ELISA試劑盒判定為陰性的55份大鼠血清在最適反應(yīng)條件下，按問接LISA程序進(jìn)行測(cè)定，求出OD450平均值X和標(biāo)準(zhǔn)差SD。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，OD450≥ X+3SD時(shí)，判為陽性；OD450＜ X+3SD時(shí)，判為陰性。

1.5.3 交叉反應(yīng)試驗(yàn) 以純化重組蛋白作為抗原包被ELISA板，檢測(cè)H-1、KRV陽性血清，確定重組抗原與其他大鼠病毒陽性血清是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.5.4 敏感性試驗(yàn) 將RPV毒株陽性血清按照1∶50、1∶100、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000的梯度稀釋，檢測(cè)建立的間接ELISA方法的靈敏度。

1.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) (1)批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：抽取血清樣品10份，每份血清樣品平行做5孔，用建立的間接ELISA方法檢測(cè)，計(jì)算其變異系數(shù)。(2)批間重復(fù)試驗(yàn)：在相同的試驗(yàn)條件下，用2批重組VP2包被ELISA板，對(duì)10份血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，計(jì)算其變異系數(shù)。

1.5.6 樣品檢測(cè) 采用本試驗(yàn)建立的iVP2-ELISA方法對(duì)上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的165份待檢血清進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算樣品陽性率。

2 結(jié)果

2.1 VP2重組蛋白的表達(dá)與純化鑒定將合成的VP2片段克隆入pET30a載體中，挑取測(cè)序正確的重組菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果見圖1A。0.5 mmol/LIPTG誘導(dǎo)的重組菌在20 kDa左右處可發(fā)現(xiàn)特異性的條帶。經(jīng)His鎳柱純化后可見明顯的單一表達(dá)條帶，純化后的重組蛋白經(jīng)Bradford法測(cè)定濃度為0.28 mg/mL。將純化后產(chǎn)物和空載體菌轉(zhuǎn)移至NC膜，利用本實(shí)驗(yàn)室制備的2E7單抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果圖1B。在20 kDa左右，重組純化蛋白具有明顯的反應(yīng)條帶。

2.2 間接ELISA方法的建立

2.2.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定 方陣實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)抗原包被最佳稀釋倍數(shù)為1∶1000（此時(shí)蛋白質(zhì)量濃度為0.28 μg/mL）、待檢血清以1∶2000稀釋時(shí)，P/N值最大，結(jié)合陰陽性血清的OD450值，確定抗原最佳包被質(zhì)量濃度為0.28 μg/mL（即28 ng/孔），血清最適稀釋度為1:2000。

2.2.2 臨界值的確定 用初步確定的條件，對(duì)55份（1∶100倍稀釋）RPV陰性血清樣本的OD450測(cè)定后計(jì)算得平均值X和標(biāo)準(zhǔn)差SD分別為0.263與0.079。計(jì)算出RPV VP2間接ELISA的判斷標(biāo)準(zhǔn)：樣本 OD450≥0.5為陽性；樣本OD450＜0.5為陰性。

2.2.3 交叉反應(yīng)試驗(yàn) 采用iVP2-ELISA方法檢測(cè)H-1、KRV陽性血清，結(jié)果見表1。結(jié)果表明, 上述血清均為陽性，說明制備的VP2抗原與上述病原存在一定的交叉反應(yīng)。

2.2.4 敏感性試驗(yàn) 采用建立好的iVP2-ELISA方法檢測(cè)不同稀釋倍數(shù)的RPV陽性血清時(shí)，可看出當(dāng)陽性血清稀釋到2000倍時(shí)仍能檢測(cè)到（表2），表明本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA檢測(cè)方法靈敏度較高。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) （1）批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：選取10份血清樣品，用建立的VP2-ELISA進(jìn)行5次批內(nèi)重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果見表3。批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)集中在2.175%～5.567%，表明建立的檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性。（2）批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：用建立的VP2-ELISA，取10份血清樣品分別用3個(gè)不同批次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4。3次檢測(cè)的陰、陽性結(jié)果完全一致。

圖1 SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)pET30a-VP2重組蛋白的表達(dá)與純化Fig.1 Identi fication of the recombinant protein by SDSPAGE and Western blotting analysis

表1 交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The result of cross-reaction

表2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of sensitivity test

表3 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of intra-assay of indirect ELISA

表4 批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table4 The result of inter-assay of indirect ELISA

2.2.6 樣品檢測(cè)結(jié)果 采用本試驗(yàn)建立的iVP2-ELISA方法對(duì)上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的165份待檢血清進(jìn)行檢測(cè)，編號(hào)為31的樣品為陽性，陽性率為0.61%。

3 討論

RPV在鼠群中感染非常普遍，且可長(zhǎng)期帶毒，這給動(dòng)物生產(chǎn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)帶來了嚴(yán)重干擾。因此，研制一種操作簡(jiǎn)便、快速、敏感性高、特異性好，適用于檢測(cè)大規(guī)模樣品的ELISA診斷方法具有重要意義。

細(xì)小病毒的VP2蛋白是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答[8]。有報(bào)道顯示，缺失VP2基因的豬細(xì)小病毒突變體均喪失了對(duì)宿主細(xì)胞的再感染性，而且VP2蛋白是PPV中和抗體的靶蛋白[9,10]。Ball-Goodrich 等[5]研究結(jié)果表明在RPV的感染過程中大鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗VP2蛋白的特異性抗體。因此，VP2在診斷細(xì)小病毒的感染和對(duì)其進(jìn)行免疫預(yù)防都具有重大意義。

本研究分析比對(duì)大鼠細(xì)小病毒RPV株、H-1株、KRV株、RMV和MVM株的VP2蛋白序列，原核表達(dá)了一段特異的RPV-VP2成熟肽，以純化表達(dá)產(chǎn)物為抗原，建立間接ELISA方法。該方法在重復(fù)性和敏感性方面優(yōu)于HI法, 且血清樣品不需特殊處理和特殊設(shè)備，適于大批量樣品的檢測(cè)[11,12]。

但是，本研究也存在一定的不足，因?yàn)樗x取的靶蛋白氨基酸序列與KRV、H-1、MVM和RMV株的同源性在70%～79%，所建立的iVP2-ELISA方法對(duì)于H-1和KRV株的陽性血清存在輕微的交叉反應(yīng)。其次，以原核表達(dá)產(chǎn)物為包被抗原所建立的間接ELISA法極易受到原核表達(dá)系統(tǒng)中雜蛋白成分的干擾而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，降低了方法的特異性。為彌補(bǔ)這些不足，本研究還在制備多株VP2單抗，擬在下一步將VP2單抗作為競(jìng)爭(zhēng)抗體，建立檢測(cè)大鼠細(xì)小病毒中和抗體的阻斷ELISA檢測(cè)方法。該方法能大大提高檢測(cè)抗體的特異性，為大鼠細(xì)小病毒、大鼠微小病毒和細(xì)小病毒感染的鑒別診斷提供可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。