程序性壞死在肝移植圍術(shù)期誘導(dǎo)腸損傷中的研究進(jìn)展

王永旺，王清平，喻文立，杜洪印

肝移植期間由于阻斷下腔靜脈（IVC）和門(mén)靜脈（PV），引起腸黏膜充血性缺血，導(dǎo)致腸道運(yùn)動(dòng)下降和腸黏膜屏障功能破壞［1］。腸黏膜屏障中復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致腸源性細(xì)菌和內(nèi)毒素過(guò)度產(chǎn)生，增加細(xì)菌轉(zhuǎn)移或內(nèi)毒素進(jìn)入靜脈或淋巴系統(tǒng)，導(dǎo)致腸外遠(yuǎn)隔器官損傷［2］。因此，肝移植圍術(shù)期保護(hù)腸黏膜上皮細(xì)胞屏障，是圍術(shù)期管理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是預(yù)防多器官功能衰竭（MODF）和全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）的有效策略。程序性壞死是一種新發(fā)現(xiàn)的壞死調(diào)控通路，其功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育及組織平衡，在腸組織缺血再灌注損傷（IRI）中具有重要作用［3］。程序性壞死不同于凋亡，可以引起SIRS，并表現(xiàn)為大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)［4］。程序性壞死發(fā)生發(fā)展包括線粒體裂解、溶酶體和胞膜裂解，具有細(xì)胞壞死的特點(diǎn)，但卻與通常理解的壞死不同，其中最重要的不同是其核質(zhì)沒(méi)有發(fā)生明顯變化，而且可以被受體交互蛋白1（receptor-interacting protein kinases-1，RIPK1）特異性阻斷劑necrostatin-1 逆轉(zhuǎn)［3］。本研究將從肝移植圍術(shù)期腸損傷發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)、腸道并發(fā)癥發(fā)生原因、程序性壞死機(jī)制等幾個(gè)方面進(jìn)行綜述。

1 腸-肝軸的意義

肝臟與腸道在胚胎發(fā)育階段擁有共同的起源——前腸。腸道淋巴細(xì)胞起源于發(fā)育中的肝臟，表明2個(gè)器官之間在解剖結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能上存在諸多內(nèi)在聯(lián)系。腸道與外界環(huán)境相通，微生物群寄居于此，含有比人類(lèi)多數(shù)倍的基因原材料，可以產(chǎn)生無(wú)數(shù)的代謝物質(zhì)，如激素/肽類(lèi)、抗原/細(xì)菌相關(guān)模式分子（P/MAMPs）、細(xì)菌產(chǎn)物/毒素。肝臟不僅暴露在腸源性P/MAMPs，而且吸收腸道產(chǎn)生的細(xì)菌代謝物、微生物與乙醇、乙醛、三甲胺和短鏈游離脂肪酸等食物作用代謝物，是大多數(shù)肝病的發(fā)病原；如酒精性或非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）［5］、脂肪性肝炎（NASH）［5］、肝細(xì)胞性肝癌［6］、進(jìn)行性肝纖維化/肝硬化和肝硬化并發(fā)癥［7］。肝硬化形成后，自身病變導(dǎo)致腸黏膜屏障功能紊亂和腸源性細(xì)菌移位，從而引起并發(fā)癥，如肝性腦病、自發(fā)性細(xì)菌感染和腹膜炎、肝腎綜合征以及血流動(dòng)力學(xué)紊亂［8］。甚至，肝硬化患者的膽汁酸池和信號(hào)通路也發(fā)生較大改變?？傊斡不瘯r(shí)腸黏膜損傷是多因素共同作用的結(jié)果。肝硬化時(shí)腸道內(nèi)膽汁缺乏，腸黏膜失去了膽汁的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用；腸道內(nèi)細(xì)菌移位和內(nèi)毒素增多，直接破壞腸黏膜屏障，并引起炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和壞死增加、細(xì)胞增殖受到抑制等，使腸黏膜損傷進(jìn)一步加重。

2 肝移植術(shù)胃腸并發(fā)癥及機(jī)制

肝硬化患者常常發(fā)生胃腸道（gastrointestinal，GI）癥狀。研究報(bào)道，大約80%肝硬化患者，伴隨1到多個(gè)胃腸相關(guān)癥狀的發(fā)生［9］。肝移植圍術(shù)期常見(jiàn)胃腸癥狀包括腹脹（49.5%）、腹痛（24%）、腹瀉（13.3%）以及便秘（8%）［9］。胃腸癥狀嚴(yán)重程度與肝臟疾病嚴(yán)重程度、乳果糖使用、腹水癥狀和心理應(yīng)激［9］以及血清睪酮水平直接相關(guān)。而門(mén)靜脈高壓腸道微血管病變癥狀，可能出現(xiàn)在所有胃腸道［10］。研究證實(shí)，肝硬化患者腸道運(yùn)輸功能不全，其中35%的患者具有不同程度的小腸動(dòng)力延遲和蠕動(dòng)緩慢，這可能與腹瀉和腹痛增加有關(guān)［11］。小腸細(xì)菌過(guò)度增殖也與肝硬化直接相關(guān)［12］。因此，肝硬化引起小腸運(yùn)輸延遲，導(dǎo)致小腸細(xì)菌增殖，進(jìn)而引起腹痛和腹瀉。文獻(xiàn)報(bào)道，小腸細(xì)菌增殖可導(dǎo)致細(xì)菌移位和感染性并發(fā)癥，例如自發(fā)性細(xì)菌腹膜炎［12］。

肝硬化患者腸黏膜通透性增加，伴隨發(fā)生細(xì)菌移位進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)，導(dǎo)致腹水產(chǎn)生，引起自發(fā)性腹膜炎［13］。而且，肝硬化患者腸道細(xì)菌產(chǎn)物、內(nèi)毒素和細(xì)菌DNA可能引起免疫系統(tǒng)激活，導(dǎo)致循環(huán)狀態(tài)紊亂，引起腎衰竭和肝性腦?。?］。肝硬化并發(fā)癥發(fā)生是由于肝臟清除內(nèi)毒素能力下降，炎性細(xì)胞因子的生成過(guò)多；如內(nèi)毒素誘發(fā)巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮和促炎因子；促炎因子和一氧化氮釋放反過(guò)來(lái)進(jìn)一步引起腸黏膜屏障功能紊亂［8］，導(dǎo)致免疫和血流動(dòng)力學(xué)紊亂，心功能不全［14］。文獻(xiàn)報(bào)道，酒精性肝病患者誘導(dǎo)發(fā)生脂肪性肝炎前，酒精先誘導(dǎo)腸道滲漏和內(nèi)毒素血癥［5］。此研究提出“滲漏”的腸道可能在慢性肝病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

肝硬化腸黏膜屏障功能不全的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜。乙醇和其代謝物乙醛及脂肪酸乙酯主要通過(guò)一氧化氮調(diào)控氧化應(yīng)激和活性氧（ROS）產(chǎn)生，細(xì)胞支架改變可能導(dǎo)致緊密連接紊亂；同時(shí)也可以導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞（IEC）直接損傷［15］。門(mén)靜脈高壓本身可能導(dǎo)致細(xì)胞間隙擴(kuò)張的腸壁水腫，影響腸黏膜屏障完整性，導(dǎo)致腸黏膜通透性增加［12］。而且，腸道特別是小腸細(xì)菌增殖引起微生物生態(tài)系統(tǒng)紊亂，影響腸黏膜屏障功能，增加腸黏膜通透性；研究發(fā)現(xiàn)，帕內(nèi)特細(xì)胞抗菌宿主防御功能不良，引起肝硬化大鼠細(xì)菌移位［16］。腸黏膜屏障功能不良，不僅發(fā)生在肝移植圍術(shù)期或急性排斥反應(yīng)損傷后，而且還可以見(jiàn)于術(shù)前營(yíng)養(yǎng)不良。肝移植術(shù)后腸黏膜屏障損害程度不同見(jiàn)于腸道運(yùn)動(dòng)減弱、結(jié)構(gòu)破壞和分泌減少，導(dǎo)致腸機(jī)械屏障損傷。甚至，腸道微生態(tài)失衡和消化液分泌減少損傷化學(xué)和生物屏障。腸道相關(guān)淋巴組織萎縮和腸道分泌IgA 減少，引起免疫屏障失效［17］。因此，腸黏膜屏障的保護(hù)對(duì)肝移植受體顯得尤為重要。

3 程序性壞死與肝移植術(shù)腸損傷

3.1 程序性壞死的分子機(jī)制 當(dāng)發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子（TNF）可以激活不同途徑的細(xì)胞死亡，凋亡調(diào)節(jié)和壞死的被動(dòng)調(diào)節(jié)的觀念已經(jīng)受到挑戰(zhàn)［18］。細(xì)胞死亡與典型凋亡的形態(tài)變化一致，表現(xiàn)為凋亡小體形成、細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝集、細(xì)胞膜致密變化和空泡樣變性。但是，在程序性壞死刺激時(shí)，TNF可以引起細(xì)胞壞死，包括細(xì)胞器腫脹、大量的空泡形成和核固縮［18］。既往認(rèn)為壞死的發(fā)生存在著被動(dòng)性和未調(diào)控性，但以上研究提示壞死在腸黏膜上皮細(xì)胞受腫瘤壞死因子受體（TNFR）調(diào)控。當(dāng)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）活性被阻斷后凋亡受到抑制，出現(xiàn)死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死；然而關(guān)于死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死的生理特點(diǎn)尚不明確［19］。2003年，Chan 等［20］研究表明 RIP1 在獨(dú)立于凋亡途徑的 TNF誘導(dǎo)細(xì)胞壞死通路中具有重要意義，也第一次把“壞死”和“程序性”組合起來(lái)，成為程序性壞死。程序性壞死隨后演變?yōu)閴乃佬缘蛲觥?/p>

敲除caspase-8 或Fas 相關(guān)死亡域蛋白（FADD）基因后，然后再分別敲除RIP1 或RIP3 基因大鼠，形成caspase-8/RIP3 或FADD/RIP1 基因缺失雙突變鼠［21］。該研究結(jié)果顯示，胚胎表型 caspase-8 或FADD缺失鼠直接受RIP1和RIP3調(diào)節(jié)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這些大鼠的細(xì)胞并未發(fā)生死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。提示在胚胎發(fā)展時(shí)期FADD 和caspase-8 的功能是為了調(diào)控RIP調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡。

研究證實(shí)，程序性壞死和凋亡一樣，也可受到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)控；而且細(xì)胞凋亡和程序性壞死的調(diào)節(jié)信號(hào)分子具有高度的重疊性［22-23］。在生理?xiàng)l件下，TNFR 可以形成TNFR 復(fù)合體Ⅰ，其可以調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和參與形成分子信號(hào)TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD）、TNFR相關(guān)因子2/5（TRAF2/5）、細(xì)胞凋亡抑制蛋白1/2（cIAP1/2）和RIP1［24］。復(fù)合體形成后激活典型的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，增加細(xì)胞存活［25］。相反，在細(xì)胞激活狀態(tài)下，環(huán)境影響TNF-α 結(jié)合誘導(dǎo)形成選擇性TNFR 復(fù)合體：TNFR 復(fù)合體Ⅱ，即著名的死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC）。TNFR 復(fù)合體Ⅱ促進(jìn)凋亡，組成包括 FADD、TRADD 和 caspase-8［26］。有研究表明，TNFR 復(fù)合體Ⅱ可引起凋亡，并招募RIP1、RIP3來(lái)誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)程序性壞死［26］。程序性壞死通路：RIP1 首先在去泛素化酶（Cyld）作用下完成去泛素化［26］，然后 RIP1 結(jié)合到 TNFR 復(fù)合體Ⅱ，通過(guò)結(jié)合RIP同型交互模體RIP3［27］。在穩(wěn)定條件下，caspase-8 通過(guò)蛋白酶裂解，控制RIP1 和RIP3 激活，抑制程序性壞死［19］。另外，去泛素化酶Cyld是caspase-8的底物。TNF-α 激活后，caspase-8 清除 Cyld，抑制RIP1 去泛素化，導(dǎo)致泛素化的RIP1 結(jié)合存活復(fù)合體［28］。但是，當(dāng)通過(guò)藥理手段敲除 caspase-8 基因后，復(fù)合體Ⅱ不會(huì)抑制RIP1 和RIP3 的激活，那么就可以限定的機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)RIP3自身磷酸化，從而引起細(xì)胞程序性壞死。RIP1 和RIP3 的蛋白表達(dá)已經(jīng)被認(rèn)為是壞死性凋亡的必要過(guò)程，RIP3決定了細(xì)胞走向程序性壞死的敏感性［29］。

3.2 程序性壞死在肝移植術(shù)腸損傷中的作用 腸上皮細(xì)胞增殖和凋亡受到體內(nèi)信號(hào)嚴(yán)格調(diào)控，從而保證腸黏膜完整性及腸屏障功能有效性。腸組織的絨毛頂端和隱窩區(qū)域是IEC 發(fā)生死亡的常見(jiàn)部位。腸黏膜發(fā)生缺血缺氧損傷后，細(xì)胞死亡可以清除損傷、老化的細(xì)胞，增殖形成新的細(xì)胞層。程序性壞死可以快速破壞腸細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）等物質(zhì)釋放，例如HMGB1 蛋白、熱休克蛋白、DNA和RNA，進(jìn)而引起炎性反應(yīng)［30］。IEC死亡數(shù)量過(guò)多，就會(huì)引起腸屏障破壞，細(xì)菌進(jìn)入腸壁，發(fā)生炎性反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)，IEC 特異性RIPK1 基因敲除鼠發(fā)生致命的腸道病理變化，其原因可能與FADD-caspase-8 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或者TNF 引起的炎癥有關(guān)［30］。在無(wú)菌環(huán)境下，培養(yǎng) IEC 特異性 RIPK1 敲除鼠或RIPK1/RIPK3 敲除鼠，不能抑制其凋亡和壞死的病理過(guò)程，提示RIPK1 缺乏上皮細(xì)胞的發(fā)生壞死必要因素并不包括微生物。在NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路激活時(shí)，不需要RIPK1激酶活性；但是其可以通過(guò)凋亡或程序性壞死來(lái)調(diào)控細(xì)胞死亡。一方面，RIPK1 激酶活性缺乏只會(huì)部分抑制，但不會(huì)防止RIPK3介導(dǎo)的FADD敲除IEC和角化細(xì)胞發(fā)生程序性壞死；證實(shí)體內(nèi)存在RIPK1 激酶活性依賴和不依賴2 條通路來(lái)調(diào)控程序性壞死。另一方面，RIPK1 激酶活性缺失合并敲除RIPK3 可以保護(hù)鼠免受TNF誘導(dǎo)的SIRS［31］。

研究證實(shí)，IEC 敲除FADD 后，程序性壞死自身可以激動(dòng)促炎性反應(yīng)；從而增加IEC死亡數(shù)量，最終產(chǎn)生自發(fā)性結(jié)腸炎和回腸炎［31］。鼠RIPK3基因敲除后結(jié)腸和IEC 壞死和炎癥反應(yīng)受到抑制；研究結(jié)論是RIPK3 調(diào)控IEC 程序性壞死引起的腸炎癥反應(yīng)［30］。無(wú)菌環(huán)境下抑制MyD88或TNF信號(hào)通路后，IEC敲除FADD基因鼠結(jié)腸炎發(fā)生明顯受到抑制，但不會(huì)抑制潘氏細(xì)胞壞死和回腸炎發(fā)生；結(jié)果表明RIPK3調(diào)控IEC 壞死和炎癥通路在結(jié)腸和小腸是不同的。IEC 特異性敲除caspase-8 基因后，通過(guò)RIPK3信號(hào)通路而不是TNFR1引起潘氏細(xì)胞壞死和回腸炎［30］。有趣的是，與IEC 敲除 FADD 基因鼠比，基因caspase-8 敲除后不會(huì)發(fā)生結(jié)腸炎，提示FADD和caspase-8在調(diào)控結(jié)腸IEC方面具有不同的功能。

4 小結(jié)與展望

程序性壞死是調(diào)控細(xì)胞死亡的重要通路，與凋亡不同的是，其不依賴caspase 蛋白酶的死亡方式，而是通過(guò)RIP1 和RIP3 的蛋白激酶相互作用及磷酸化程序性壞死。這種死亡模式又具有凋亡的優(yōu)勢(shì)，即可調(diào)控，可以通過(guò)阻斷劑Nec-1 調(diào)節(jié)RIP 激酶的活性控制程序性壞死的發(fā)生發(fā)展。目前研究證據(jù)說(shuō)明程序性壞死可以參與肝移植圍術(shù)期的移植物和遠(yuǎn)隔器官損傷，甚至移植物無(wú)功能和排斥反應(yīng)導(dǎo)致移植物壞死。但是仍有很多問(wèn)題函待解決，例如如何調(diào)控壞死小體激活和形成，RIPK1 和RIPK3 激酶活性是如何調(diào)控的，程序性壞死對(duì)于炎癥的啟動(dòng)、進(jìn)展以及慢性發(fā)展是如何發(fā)揮作用的等。