Rab35與腫瘤關(guān)系的研究現(xiàn)狀及展望

李美月，田文艷，王穎梅，薛鳳霞

Rab蛋白家族是Ras超家族（包括Ras、Rho/Rac、Rab、Arf 以及Ran 五大類）中最大的亞族，是一類小分子GTP 酶，分子質(zhì)量大約為20～30 ku，表達(dá)于酵母、果蠅、小鼠和人類等各種真核生物中膜相關(guān)的細(xì)胞器（如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、內(nèi)涵體等）。目前為止，研究已發(fā)現(xiàn)人體中Rab 蛋白包含70多個(gè)成員，并且在囊泡運(yùn)輸、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、膜定位和融合中起調(diào)節(jié)作用［1］。除了在發(fā)育和生理學(xué)中的作用，Rab蛋白也已被證明與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［2］。Rab35 是Rab 鳥嘌呤三核苷酸磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶家族的成員，是在質(zhì)膜和內(nèi)涵體上有獨(dú)特定位的Rab GTP 酶，在內(nèi)吞胞吐循環(huán)和胞質(zhì)分裂中發(fā)揮重要作用［3］。另外，Rab35與多種腫瘤遷移和侵襲等生物學(xué)特性有關(guān)，本文就此作一綜述。

1 Rab35概述

1.1 Rab35的來(lái)源和命名 Rab35于1994年首次從人胎兒骨骼肌cDNA 文庫(kù)中被發(fā)現(xiàn)和克隆得到［4］。在 Rabs 中，Rab35 與酵母 Ypt1p、哺乳動(dòng)物的 Rab1a和 Rab1b 同源性最高，盡管 Rab35 與 Rab1a、Rab1b具有較高的同源性，但它們?cè)贑-末端最后30個(gè)氨基酸明顯不同，因而Rab35 被命名為Rab1c 或H-Ray（或Ray）。隨后研究者對(duì)編碼真核細(xì)胞膜運(yùn)輸機(jī)制的基因進(jìn)行比較基因組分析后，將其標(biāo)注為Rab35。

1.2 Rab35的活化及失活 Rab35可與GTP 或鳥嘌呤二核苷酸磷酸（guanosine diphosphate，GDP）結(jié)合，形成活化及失活兩種形式，主要由鳥嘌呤核苷酸交換因子（Guanine nucleotide exchange factors，GEFs）和GTP酶激活蛋白（GTPase-activating proteins，GAPs）來(lái)調(diào)節(jié)。GEFs催化Rab35與GTP結(jié)合，將Rab35 GDP轉(zhuǎn)化為Rab35 GTP，即活性形式；GAPs促進(jìn) GTP 酶活性升高，GTP 酶將 Rab35 GTP 轉(zhuǎn)換成Rab35 GDP，即失活形式，因此，Rab35 GTP/GDP 循環(huán)由GEFs和GAPs來(lái)控制［5］。

已有研究證實(shí)，Rab35 特異性GEFs 有Connecdenn1、 Connecdenn2、 Connecdenn3 及Folliculin 蛋白（FLCN）4種。Connecdenn1～3又稱為DENND1A～C，該類分子的DENN（differentially expressed in neoplastic versus normal cells）結(jié)構(gòu)域可作為 Rab35的GEF發(fā)揮作用［6］。Rab35 與 DENN 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，可降低Rab35與GDP的親和力，促進(jìn)GDP與Rab35解離，從而使GTP得以結(jié)合Rab35［7］。FLCN 是一種潛在的Rab35 GEF，該基因位于17p11.2 號(hào)染色體上。FLCN基因突變會(huì)引起B(yǎng)irt-Hogg-Dubé 綜合征（BHD），該綜合征以皮膚良性腫瘤和腎癌發(fā)生率升高為特征。FLCN 的主要序列不存在可辨別的DENN結(jié)構(gòu)域，但FLCN的C末端部分的結(jié)構(gòu)存在DENN結(jié)構(gòu)域［8］。研究發(fā)現(xiàn)，Rab35特異的GAPs 有TBC1D10A、TBC1D10B、TBC1D10C，均含有特異的TBC（Tre2/Bub2/Cdc16）結(jié)構(gòu)域。TBC結(jié)構(gòu)域是一個(gè)含有180～200 個(gè)氨基酸殘基的保守片段，具有Rab GAP 活性，通過(guò)催化GTP 水解來(lái)降低Rabs活性［9］。

1.3 Rab35的效應(yīng)物 Rab35與GTP 結(jié)合后形成活性形式，其下游有一系列的效應(yīng)物，參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞骨架形成等，已發(fā)現(xiàn)的Rab35的效應(yīng)物有OCRL（the Oculo-Cerebro-Renal syndrome of Lowe）、肌成束蛋白、RUSC2（RUN and SH3 domain containing 2）、MICAL（Molecule interacting with casL）、ACAP2（Arf-GAP with coiled-coil,ANK repeat and PH domain-containing protein 2）等。

2 Rab35的功能及其與腫瘤發(fā)生有關(guān)的機(jī)制

Rab35參與許多細(xì)胞功能，包括胞質(zhì)分裂、細(xì)胞極性、細(xì)胞遷移、膜運(yùn)輸、吞噬作用、外來(lái)體釋放、膜脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)突生長(zhǎng)和免疫突觸形成等。

2.1 Rab35 在胞質(zhì)分裂和細(xì)胞兩極分裂中的功能 細(xì)胞有絲分裂末期是指從子染色體到達(dá)兩極開始，至形成兩個(gè)子細(xì)胞為止的時(shí)期，涉及兩個(gè)關(guān)鍵步驟即細(xì)胞胞質(zhì)分裂及細(xì)胞兩極分裂。Fremont 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，Rab35 為參與細(xì)胞有絲分裂末期的關(guān)鍵蛋白，在果蠅細(xì)胞中Rab35 是一種能導(dǎo)致胞質(zhì)分裂缺陷表型（雙核細(xì)胞）的蛋白，OCRL作為Rab35的效應(yīng)物在細(xì)胞分裂中具有明顯的作用，敲低Rab35 或OCRL后可導(dǎo)致磷脂酰肌醇4,5-二磷酸［PI（4,5）P2］和F-actin在細(xì)胞間橋中異常積累，進(jìn)一步證實(shí)了活化的Rab35 結(jié)合OCRL，可將OCRL 募集到細(xì)胞間橋，OCRL 水解 PI（4，5）P2 并刺激 F-actin 從細(xì)胞間橋清除，最終使細(xì)胞分離。此外，有研究也證實(shí)，小鼠乳腺上皮細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中F-actin 在細(xì)胞間橋中異常積累可導(dǎo)致四倍體細(xì)胞形成，從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生［11］。

同樣作為Rab35 新興的效應(yīng)物，MICAL 家族為細(xì)胞分裂過(guò)程中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)變化和膜運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［12］。人類 MICAL 家族有3個(gè)MICAL蛋白（MICAL1、MICAL2、MICAL3）和 2 個(gè)MICAL-L 蛋白（MICAL-L1、MICAL-L2），其含有對(duì)肌動(dòng)蛋白解聚必需的N-末端黃素蛋白單加氧酶（MO）結(jié)構(gòu)域、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合的鈣調(diào)蛋白同源性（CH）結(jié)構(gòu)域、LIM 結(jié)構(gòu)域（Lin- 11，Isl-1 和Mec-3）和Rab 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）。盡管MICAL1 和MICAL3具有共同的結(jié)構(gòu)域，但在細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)揮不同的功能，MICAL1 通過(guò)對(duì)F-actin 的解聚影響細(xì)胞分裂，而MICAL3作為囊泡靶向的中間體，與細(xì)胞間橋的穩(wěn)定性有關(guān)。MICAL-L蛋白中不存在MO結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞分裂的機(jī)制不涉及任何氧化還原作用。MICAL-L1 的缺失可導(dǎo)致紡錘體長(zhǎng)度異常，染色體分裂滯后，細(xì)胞雙核化，進(jìn)而影響細(xì)胞分裂。

在基質(zhì)膠中培養(yǎng)的犬腎細(xì)胞（MDCK）可形成具有中心頂端腔的單細(xì)胞層球體（囊腫），每個(gè)囊腫由單個(gè)初始非極性細(xì)胞連續(xù)分裂產(chǎn)生。研究顯示，Rab35與MDCK 囊腫發(fā)育中的細(xì)胞基底極性的建立有關(guān)，Rab35從物理動(dòng)力學(xué)上參與胞質(zhì)分裂與頂端-基底極性的啟動(dòng)［13］。果蠅體內(nèi)無(wú)縫管的形成也證實(shí)了Rab35 參與細(xì)胞兩極分裂；無(wú)縫管的生長(zhǎng)沿著近端軸線極化，并且由Rab35 及GAP Whacked（EPI64A-C的同源物）調(diào)節(jié)，GTP結(jié)合Rab35調(diào)控頂端膜囊泡運(yùn)輸?shù)浇K端細(xì)胞分支的遠(yuǎn)端，從而誘導(dǎo)無(wú)縫管生長(zhǎng)［14］。

2.2 Rab35 在細(xì)胞遷移中的功能 研究已經(jīng)證實(shí)，Rab35 和Arf6 可調(diào)節(jié)內(nèi)吞作用、黏附分子的分選和再循環(huán)，控制肌動(dòng)蛋白重塑、細(xì)胞遷移和胞質(zhì)分裂。另有研究顯示，Rab35 和Arf6 通常以極性相反的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞活性［15］。在細(xì)胞黏附的調(diào)控中存在Rab35 和Arf6 的相反作用。在上皮細(xì)胞中，Arf6 活化后通過(guò)促進(jìn)E-鈣黏蛋白的內(nèi)吞作用和靶向E-鈣黏蛋白到溶酶體的降解來(lái)破壞細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附連接；而Rab35激活可維持細(xì)胞表面上的E-鈣黏蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞之間的黏附。Rab35 和Arf6 在細(xì)胞遷移中也具有相反的功能。Arf6是整合素主動(dòng)回收所必需，可導(dǎo)致整合素在細(xì)胞表面表達(dá)升高和信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)，隨后刺激細(xì)胞遷移；Rab35可抑制整合素回收，敲低Rab35會(huì)促進(jìn)整合素回收到表面，增強(qiáng)細(xì)胞遷移。因此，Arf6可限制細(xì)胞黏附，促進(jìn)細(xì)胞遷移，而Rab35 促進(jìn)細(xì)胞黏附，限制細(xì)胞遷移。Rab35水平失調(diào)能特異性地?cái)_亂整合素和其他細(xì)胞黏附分子在細(xì)胞表面的表達(dá)，這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能有一定的關(guān)系。

最近研究顯示，Rab35 在肺癌細(xì)胞定向遷移過(guò)程中起著十分重要的作用［16］。G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用的ArfGAP2（G protein-coupled receptor kinase interacting ArfGAP 2，GIT2）參與不同的細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)變化、膜運(yùn)輸和黏著斑交換。RUSC2為一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，為GIT2的公認(rèn)結(jié)合伴侶。研究證實(shí)，GIT2依賴RUSC2對(duì)高爾基體的調(diào)節(jié)控制細(xì)胞極化和方向；EGF 誘導(dǎo)Rab35 激活是細(xì)胞定向遷移期間RUSC2-GIT2 復(fù)合物形成所必需的，即 EGF 刺激 Rab35 活化，活化的 Rab35 與 RUSC2 結(jié)合，并促進(jìn)RUSC2 和GIT2 的結(jié)合。鑒于Rab35 對(duì)GIT2-RUSC2 復(fù)合物的調(diào)節(jié)，該研究又進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)，Rab35 的沉默也降低了GIT2 的穩(wěn)定性和磷酸化并抑制了細(xì)胞遷移。因此，Rab35/RUSC2/GIT2通路是肺癌細(xì)胞中EGFR 誘導(dǎo)的定向遷移的中心，該通路有望成為肺癌轉(zhuǎn)移的新的治療靶標(biāo)［16］。

乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位，乳腺癌細(xì)胞常轉(zhuǎn)移到腦、肺等遠(yuǎn)端器官，乳腺癌的預(yù)后與其轉(zhuǎn)移程度密切有關(guān)。Zhu 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，Rab35 是乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中細(xì)胞遷移所必需的，該細(xì)胞中Rab35 活性能被Wnt5a 和Dvl2 顯著激活，并且在敲低Wnt5a 和Dvl2 表達(dá)時(shí)Rab35 活性亦下調(diào)；此外，通過(guò)Rab35 shRNA阻斷Rab35活性顯著地抑制了Wnt5a誘導(dǎo)的Rac1活性，且可抑制MCF-7細(xì)胞遷移。因此，Rab35 作用于 Wnt5a 和 Dvl2 的下游和Rac1 的上游以促進(jìn)細(xì)胞遷移，即通過(guò)Wnt5a/Dv12/Rab35/Rac1信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移［17］，這為臨床治療中選擇更準(zhǔn)確的乳腺癌治療靶點(diǎn)提供了重要的線索。Deng等［18］研究也發(fā)現(xiàn)，Rab35/MICAL1的活化可促進(jìn)ROS 產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致PI3K/Akt 信號(hào)活化，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲，認(rèn)為Rab35 和MICAL1 之間有調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞侵襲的新型關(guān)系，但關(guān)于Rab35 如何精確調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞中的MICAL1 仍有待研究。

2.3 Rab35 受miRNA 調(diào)控的相關(guān)機(jī)制 子宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤第4位。研究顯示，與正常子宮頸組織相比，子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-720 表達(dá)顯著上調(diào)，表明miR-720 與子宮頸癌發(fā)生有關(guān)［19］。Tang 等［20］發(fā)現(xiàn)，miR-720通過(guò)負(fù)性調(diào)控Rab35來(lái)促進(jìn)子宮頸癌HeLa細(xì)胞的遷移；該研究評(píng)估了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的改變，結(jié)果顯示抑制miR-720 和過(guò)表達(dá)Rab35 對(duì)E-鈣黏蛋白和波形蛋白水平具有相反的作用：E-鈣黏蛋白增加，波形蛋白減少。因此，miR-720 可促進(jìn)HeLa 細(xì)胞遷移的內(nèi)在機(jī)制本質(zhì)上是通過(guò)下調(diào)Rab35和EMT激活，但是miR-720/Rab35 軸在動(dòng)物模型和臨床組織中的功能尚未完全明確，仍需要進(jìn)一步研究。

2.4 Rab35受性激素調(diào)控的相關(guān)機(jī)制 卵巢癌是一種激素依賴性惡性腫瘤。流行病學(xué)研究證實(shí)，高雄激素水平與上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancers，EOC）的發(fā)展相關(guān)［21］。Sheach等［22］研究也發(fā)現(xiàn)，雄激素可促進(jìn)雄激素受體（AR）陽(yáng)性的卵巢癌細(xì)胞OVCAR3（卵巢上皮細(xì)胞癌）增殖，且顯著上調(diào)該細(xì)胞GTP 酶的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖及遷移；另外，Rab35（雄激素應(yīng)答中上調(diào)最明顯）與AR表達(dá)呈顯著正相關(guān)。因此，Rab35和AR表達(dá)相關(guān)的發(fā)現(xiàn)支持了Rab35是雄激素應(yīng)答基因的觀點(diǎn)，Rab35蛋白有望成為反映卵巢癌中AR 功能的生物學(xué)標(biāo)志物。預(yù)測(cè)哪些患者可能對(duì)抗雄激素治療有反應(yīng)，但Rab35 在卵巢癌中的具體功能仍需要進(jìn)一步的研究。

3 展望

綜上所述，隨著對(duì)Rab35研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)作為調(diào)節(jié)因子所參與的細(xì)胞生理功能越來(lái)越多樣化，從質(zhì)膜受體再循環(huán)，到胞質(zhì)分裂、蛋白質(zhì)分泌、吞噬作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，乃至腫瘤的發(fā)生，Rab35均發(fā)揮了不容忽視的關(guān)鍵作用。除此之外，其在機(jī)體組織器官發(fā)育和分化，以及疾病發(fā)生方面還有一些尚未明確的潛在的重要功能。因此，Rab35是現(xiàn)有研究腫瘤的一個(gè)重要基因，其參與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲特性是引起腫瘤表達(dá)變化的重要原因之一。而目前對(duì)Rab35 的研究有限，雖然已經(jīng)初步獲得成果，但其確切的生物學(xué)特性及影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制仍將會(huì)成為今后研究的熱點(diǎn)。探索Rab35的生物學(xué)特性和影響機(jī)制，將會(huì)對(duì)探索控制腫瘤的新靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)支持，從而指導(dǎo)臨床診斷、治療及預(yù)后評(píng)估。