調(diào)節(jié)曲霉屬真菌毒素合成的群體感應(yīng)分子機(jī)制的研究進(jìn)展

彭夢雪 梁志宏

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083）

曲霉屬（Aspergillus spp.）真菌隸屬于半知菌亞門（deuteromycotina）絲孢綱（hyphomycetes）絲孢目（hyphomycetales）叢梗孢科（moniliaceae），廣泛分布于土壤、空氣和農(nóng)作物中，屬內(nèi)常見菌種主要有黃曲霉（A.flavus）、赭曲霉（A.ochraceus）、煙曲霉（A.fumigatus）、灰綠曲霉（A.glaucus）、寄生曲霉（A.parasiticus）、土曲霉（A.terreus）和雜色曲霉（A.versicolor）等[1-2]。曲霉屬真菌產(chǎn)生的毒素污染食品、飼料及藥物，人或動物攝入后可引起肝、腎毒性、生殖毒性、致癌和致突變性等[3-4]。曲霉屬真菌在土壤中以分生孢子或菌核的形式存在，在植物組織中則以菌絲體的形式存在。菌核能在極端脅迫環(huán)境條件（高溫、干旱等）下存活，并能產(chǎn)生分生孢子或子囊孢子。環(huán)境因子包括溫度、pH、光照、脂類、宿主蛋白及酚類化合物等均會影響曲霉屬真菌的菌絲生長、孢子產(chǎn)生和毒素合成[5]。研究者對曲霉屬真菌毒素的生物合成相關(guān)基因、關(guān)鍵酶及調(diào)控因子、代謝通路、環(huán)境影響因子以及阻控毒素危害等方面開展了大量的研究[3，6-7]。迄今為止，參與黃曲霉毒素生物合成的一系列基因、酶及部分調(diào)控因子已基本清楚，而其它曲霉毒素，例如赭曲霉毒素的生物合成機(jī)制尚不清晰，還不能有效控制糧食中曲霉屬真菌毒素的產(chǎn)生。

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是微生物間通過釋放一些特定的小分子化學(xué)物質(zhì)，并感知其濃度變化，來監(jiān)測群體密度并調(diào)控自身的某些生理行為，從而適應(yīng)周圍環(huán)境的一種信號交流機(jī)制，又稱為“自動誘導(dǎo)（autoinduction）”或“細(xì)胞與細(xì)胞的交流（cell to cell communication）”。群體感應(yīng)現(xiàn)象最早于20 世紀(jì)70年代，在費(fèi)氏發(fā)光弧菌（Vibrio fluvialis）[8]中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可通過群體感應(yīng)通信機(jī)制，調(diào)節(jié)其菌相轉(zhuǎn)換、毒力因子產(chǎn)生、生物膜形成、生物發(fā)光等生理活動[9]，進(jìn)而適應(yīng)環(huán)境的變化。在真菌中也發(fā)現(xiàn)類似于細(xì)菌群體感應(yīng)的密度依賴性調(diào)節(jié)現(xiàn)象，許多動植物致病菌如白色念珠菌（Candida albicans）[10]、新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）[11]、腐榆角藻菌（Ceratocystis ulmi）[12]等，可通過群體感應(yīng)誘導(dǎo)毒力因子的分泌，增強(qiáng)其入侵動植物的能力。此外，曲霉屬真菌的形態(tài)建成和次級代謝物的產(chǎn)生，也與群體的密度密切相關(guān)。黃曲霉以密度依賴的方式調(diào)節(jié)菌核、孢子以及黃曲霉毒素產(chǎn)生，其中低密度群體產(chǎn)生更多的黃曲霉毒素，并可以增加菌核，降低分生孢子產(chǎn)生；隨著群體密度的升高，曲霉屬真菌表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)，產(chǎn)生的菌核減少，分生孢子增加，毒素產(chǎn)量降低[13]。在赭曲霉中也發(fā)現(xiàn)類似于黃曲霉的群體密度依賴性現(xiàn)象，將不同密度的赭曲霉孢子分別接種到馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基和花生、玉米、大豆、小麥中，低密度接種情況下赭曲霉毒素A 生物合成相關(guān)基因pks的表達(dá)量更高，產(chǎn)生更多的赭曲霉毒素A[14]。

隨著分子生物學(xué)新理論和新技術(shù)的發(fā)展，尤其是基因組學(xué)和生物信息學(xué)等研究的快速發(fā)展，許多研究對曲霉屬真菌毒素生物合成的分子機(jī)制做了很多探索，其中包括群體密度依賴性的調(diào)控機(jī)制。本文以黃曲霉、赭曲霉、煙曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)毒曲霉為例，評述調(diào)控其毒素產(chǎn)生的群體感應(yīng)分子機(jī)制的相關(guān)因素，包括信號分子（主要是脂氧合物）、G 蛋白偶聯(lián)信號途徑以及氧化應(yīng)激，旨在為深化曲霉屬真菌的有毒次級代謝產(chǎn)物的生物合成機(jī)制研究提供參考。

1 曲霉屬真菌中的群體感應(yīng)現(xiàn)象

真菌群體感應(yīng)現(xiàn)象研究最多的是人類致病菌白色念珠菌（Candida albicans）。長期以來觀察到，白色念珠菌細(xì)胞密度較低時呈絲狀生長，而密度較高時以出芽酵母形態(tài)生長，其信號分子是法尼醇（farnesol）[15]、酪醇[16]等。此外，還在酵母[17-18]、新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）[11]、曲霉屬真菌[13]中發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)現(xiàn)象。曲霉屬真菌菌體的形態(tài)建成和次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與群體密度有關(guān)。黃曲霉以密度依賴方式繁殖，在低群體密度時菌核產(chǎn)量增加，分生孢子減少，黃曲霉毒素產(chǎn)量較高，高群體密度時則相反。

目前發(fā)現(xiàn)的曲霉屬真菌群體感應(yīng)信號分子主要是脂氧合物（oxylipins）[19]，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑是G 蛋白偶聯(lián)信號途徑。在構(gòu)巢曲霉中，發(fā)現(xiàn)G 蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptors，GPCRs）參與了與次級代謝，性發(fā)育，應(yīng)激信號和氨基酸代謝相關(guān)的基因調(diào)控[20-21]。在這些GPCRs 缺失的真菌中觀察到代謝轉(zhuǎn)變，并引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，這反映調(diào)節(jié)環(huán)境變化的代謝反應(yīng)的微調(diào)機(jī)制[20]。對煙曲霉G蛋白偶聯(lián)受體GprC 和GprD 的缺失突變體的轉(zhuǎn)錄組分分析表明，參與初級代謝的基因下調(diào)，而幾個次級代謝基因簇的轉(zhuǎn)錄水平升高[22]。雖然早已發(fā)現(xiàn)曲霉屬真菌的群體密度依賴性的現(xiàn)象，但是其群體感應(yīng)信號分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍然有限，需要表征和鑒定更多的信號分子，以闡明曲霉屬真菌的群體感應(yīng)信號調(diào)節(jié)機(jī)制。

2 曲霉屬真菌的群體感應(yīng)信號分子

脂類物質(zhì)及其氧化產(chǎn)物（脂氧合物）與曲霉屬真菌毒素的合成具有密切的聯(lián)系，曲霉屬真菌感染油料作物種子或含油脂高的組織之后會產(chǎn)生更多的毒素[23]。脂氧合物是多不飽和脂肪酸通過酶促或非酶促反應(yīng)產(chǎn)生的氧合脂質(zhì)，是絲狀真菌、酵母、植物和動物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要信號分子[19，24]。脂氧合物（oxylipins）在曲霉屬菌株中統(tǒng)稱為性誘導(dǎo)因子（precocious sexual inducer，psi），調(diào)節(jié)曲霉屬菌株的無性和有性發(fā)育之間的平衡。

曲霉屬真菌中存在脂氧合酶（lipoxygenase，EC 1.13.11.12，LOX）同工酶，催化脂肪酸代謝產(chǎn)生脂氧合物，調(diào)控曲霉屬真菌的分生孢子、菌核和次級代謝物產(chǎn)生[25]。LOX 是脂肪酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，其主要作用是催化多不飽和脂肪酸（如亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸等）的加氧反應(yīng)，脂肪酸氫過氧化物，此過程稱為LOX 途徑或十八碳酸途徑[26]。LOX 及其代謝產(chǎn)物可影響曲霉屬真菌侵染作物種子的進(jìn)程，通過參與調(diào)控曲霉屬真菌和種子互作而不同程度地影響曲霉屬真菌生長和產(chǎn)毒，從而影響種子的黃曲霉毒素污染水平。黃曲霉的LOX 與Ppo 蛋白 （psi factor-producing oxygenases，psi-氧合酶） 一起參與群體感應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。Lox 或PpoC 突變會改變密度依賴性的菌核和分生孢子的產(chǎn)生：在細(xì)胞高密度（＞105個孢子/板）條件下，與野生型分生孢子增多和菌核減少相比，突變體的菌核增加而分生孢子減少[27-28]。

真菌的脂氧合物與動、植物的脂氧合物結(jié)構(gòu)與功能相似，這是脂氧合物作為曲霉-宿主互作信號分子的重要特征[29-30]。植物來源的脂氧合物，如13S-HPODE（hydroperoxyoctadecenoic acid，HPODE）和9S-HPODE，不僅參與植物生長發(fā)育和防御反應(yīng)，而且影響黃曲霉屬真菌、寄生曲霉屬真菌和構(gòu)巢曲霉的營養(yǎng)生長、分生孢子和菌核的形成及次級代謝產(chǎn)物合成[31-32]。Burrow 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入低濃度的9S-HPODE、13S-HPODE 均能促進(jìn)曲霉屬真菌孢子的形成，而對曲霉屬真菌產(chǎn)毒具有不同作用，低濃度的13S-HPODE（10 μmol/L 和100 μmol/L）能抑制寄生曲霉屬真菌和構(gòu)巢曲霉屬真菌中黃曲霉毒素合成基因的表達(dá)，并能顯著降低其黃曲霉毒素的產(chǎn)量，而相同濃度的9S-HPODE 不能抑制產(chǎn)毒。

脂氧合酶合成相關(guān)基因ppo（存在于真菌）和lox（存在于植物、動物和真菌）編碼合成的加氧酶類及其氧化產(chǎn)物（脂氧合物）具有調(diào)控曲霉屬真菌生長發(fā)育和產(chǎn)毒的作用[27]。構(gòu)巢曲霉的ppo 基因敲除后，其有性與無性發(fā)育之間的平衡被打亂。同時敲除黃曲霉ppo 基因 （ppoA，ppoB，ppoC 和ppoD）以及另一種產(chǎn)生脂氧合物的基因lox，可破壞黃曲霉的正常形態(tài)發(fā)育，即使群體密度從低到高變化，菌核也不會轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚咦樱疫@些敲除ppo 和lox 基因的黃曲霉侵染玉米和花生種子后，黃曲霉毒素產(chǎn)量增加。此外，ppoC 和lox 敲除突變菌株，在任何群體密度下均產(chǎn)生高水平的黃曲霉毒素[27-28]。

其它脂氧合酶代謝產(chǎn)物，如茉莉酸甲酯[33]，六碳醛和九碳醛、醇及其相應(yīng)酯類[34-35]等可作為啟動植物防御機(jī)制的信號分子，介導(dǎo)植物抵抗病原菌侵染等過程。Zeringue 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，抗黃曲霉玉米品種產(chǎn)生的揮發(fā)性醛濃度顯著高于染病品種。這些脂氧合酶代謝產(chǎn)物可直接或間接地影響真菌生長和產(chǎn)毒，從而提高作物抗真菌毒素污染的能力。

3 G 蛋白偶聯(lián)信號途徑

G 蛋白偶聯(lián)信號途徑是真核生物中普遍存在的細(xì)胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與識別并轉(zhuǎn)導(dǎo)多種胞外信號分子，對真菌的生長、分化、繁殖、致病性及真菌毒素等次生代謝產(chǎn)物合成有重要的調(diào)控作用[37]。外部的信號分子由G 蛋白偶聯(lián)受體（Gprotein coupled receptors，GPCR）識別，通過異源三聚體G 蛋白（heterotrimeric G protein，簡稱G蛋白，含3 個亞基Gα、Gβ、Gγ）完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[38]，調(diào)節(jié)cAMP 通路，調(diào)控下游反應(yīng)。

G 蛋白偶聯(lián)系統(tǒng)由4 部分組成：G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）、G 蛋白、下游效應(yīng)因子（如cAMP）以及信號調(diào)節(jié)蛋白[21，39-41]。GPCR 是一個非常龐大的跨膜受體家族，其功能和序列具有多樣性。在真菌中已發(fā)現(xiàn)存在于哺乳動物中的幾類GPCR[42]，它們結(jié)構(gòu)的共同特征是含7 個跨膜結(jié)構(gòu)域和與異源三聚體G 蛋白相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。G 蛋白偶聯(lián)受體傳遞信號的基本原理[43]是：特異性的配體（信號分子）與相應(yīng)的GPCR 結(jié)合，引起GPCR 構(gòu)象的變化；GPCR 構(gòu)象變化之后能夠結(jié)合三聚體G 蛋白（此時Gα亞基結(jié)合1 個GDP 分子），并誘導(dǎo)G 蛋白的Gα亞基構(gòu)象發(fā)生變化，使Gα亞基釋放結(jié)合的GDP，并迅速與周圍環(huán)境中的GTP 結(jié)合；結(jié)合了GTP 的Gα亞基立即與GPCR 和Gβγ亞基復(fù)合物分離；Gα亞基和Gβγ亞基分別與下游的效應(yīng)蛋白結(jié)合，通過調(diào)控效應(yīng)蛋白的活性來實(shí)現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)；Gα亞基與效應(yīng)蛋白結(jié)合后，GTP 水解成為GDP，并與Gβγ亞基形成三聚體，等待下一次信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

曲霉屬真菌可通過GPCR 來感測環(huán)境中營養(yǎng)源、發(fā)育信號、應(yīng)激壓力及來自其它生物體的信號的變化[44]。黃曲霉和其它絲狀真菌的GPCR 敲除后，突變體的生長發(fā)育和次生代謝受到破壞。在黃曲霉gprC 和gprD 突變體中發(fā)現(xiàn)，gprC 和gprD 的敲除使得高群體密度表型向低群體密度表型的轉(zhuǎn)變能力受損，即使在不利的高群體密度下，兩種菌株也產(chǎn)生較高水平的菌核和黃曲霉毒素[13]。此外，脂氧合物可以引起構(gòu)巢曲霉中cAMP 水平顯著升高，并且構(gòu)巢曲霉G 蛋白偶聯(lián)受體gprD 基因的喪失可阻止這種cAMP 積聚。2012年，Affeldt 等[13]構(gòu)建了10 種GPCR 突變體，發(fā)現(xiàn)GprD 負(fù)責(zé)識別13S-HPODE、9S-HPODE、13S-HODE（hydroxylinoleic acid，HODE）和9S-HODE。在黃曲霉中開發(fā)了一種GPCR 敲除的文庫，gprA，gprB，gprF，gprG，gprM，gprP，gprP 或gprR 敲除的菌株對外源性茉莉酮酸甲酯（一種植物的防御性脂氧合物）的作用無應(yīng)答。gprA，gprC，gprD，gprF，gprG，gprJ，gprO 或gprP 被敲除的突變體仍然應(yīng)答于亞油酸而形成孢子，而對誘導(dǎo)孢子形成的氧脂素13S-HPODE 無應(yīng)答[44]。

G 蛋白偶聯(lián)信號途徑可以作為改進(jìn)利用微生物來生產(chǎn)酶類和其它次生代謝產(chǎn)物的生物技術(shù)的重要靶標(biāo)。由于這一途徑也顯著影響了菌株的生長發(fā)育，因此應(yīng)考慮靶分子改變后的副作用，如引起菌株生長缺陷，喪失生殖能力或改變毒素產(chǎn)生等。

4 曲霉屬真菌毒素合成應(yīng)答于氧化應(yīng)激壓力

真菌侵染宿主后，宿主產(chǎn)生活性氧（ROS）作為防御武器，誘導(dǎo)真菌細(xì)胞死亡[45]。在曲霉屬真菌中，抗氧化酶的產(chǎn)生是抵抗胞內(nèi)ROS 形成的第1道防線，而次級代謝物的合成則是作為抵抗ROS傷害的第2 道防線[46-48]。絲狀真菌已經(jīng)開發(fā)出復(fù)雜而成熟的應(yīng)答系統(tǒng)以避免氧化損傷。在許多絲狀真菌（包括黃曲霉、寄生曲霉、米曲霉和構(gòu)巢曲霉）中發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與毒素生物合成之間有密切的聯(lián)系[45，48]。氧化應(yīng)激可以刺激黃曲霉中的黃曲霉毒素[49]，赭曲霉中的赭曲霉毒素A[50]，禾谷鐮刀菌中的單萜烯B[51]的積累。具有抗真菌活性的抗氧化劑（例如多酚），是曲霉屬的真菌毒素生物合成的抑制劑[52]。據(jù)報道，酚類抗氧化劑如咖啡酸或綠原酸，是幾種曲霉屬的赭曲霉毒素A 產(chǎn)生的有效抑制劑[53]。

真菌可通過產(chǎn)生次生代謝物來抵抗氧化應(yīng)激壓力所帶來的損傷，許多屬于bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白質(zhì)，協(xié)調(diào)氧化應(yīng)激與次級代謝之間的相互作用。bZIP 蛋白（如AtfA，AtfB，ApYapA 及其同系物NapA） 在絲狀真菌的生命史中起普遍的作用，它們調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，次生代謝以及形態(tài)發(fā)育[48]。在寄生曲霉中，atfB 表達(dá)不僅與黃曲霉毒素生成相關(guān)，還結(jié)合黃曲霉毒素生物合成基因的啟動子以及應(yīng)激反應(yīng)基因[54-55]。此外，在黃曲霉毒素生產(chǎn)過程中同時發(fā)生黃曲霉毒素生物合成基因轉(zhuǎn)錄物以及atfB 轉(zhuǎn)錄物的積累[55]。AtfB 可以促進(jìn)nor-1（一種黃曲霉毒素生物合成基因）的轉(zhuǎn)錄。寄生曲霉apyapA 敲除突變體對細(xì)胞外源氧化劑的易感性增加，該突變體的活性氧水平和黃曲霉毒素產(chǎn)量均增加[55]。構(gòu)巢曲霉的DApyap1 突變菌株對玉米種子的致病性增加，更早、更多地產(chǎn)生了黃曲霉毒素。構(gòu)巢曲霉的apyapA 同系物napA 過表達(dá)時，突變體更耐受氧化應(yīng)激，次級代謝產(chǎn)物合成降低[49]。另一種bZIP 蛋白，氮調(diào)節(jié)的MeaB 蛋白，可調(diào)節(jié)毒力和次級代謝[56]。當(dāng)黃曲霉屬真菌株的MeaB 過表達(dá)，其定殖于種子類宿主的能力降低，脂肪酶活性降低，并失去黃曲霉毒素合成能力。

真菌病原體氧化應(yīng)激和次生代謝產(chǎn)物之間的密切關(guān)系，可以解釋為植物宿主與真菌互作所產(chǎn)生的適應(yīng)性機(jī)制。真菌侵染宿主后，激活具有解毒活性的抗氧化劑的表達(dá)來克服植物的防御性氧化應(yīng)激壓力。例如，禾谷鐮刀菌產(chǎn)生B 型頭孢霉素[51]，赭曲霉產(chǎn)生赭曲霉毒素[14]等。次生代謝產(chǎn)物如核黃素的生物合成，是真菌清除ROS 的機(jī)制，在真菌存活中起作用[57]。真菌毒素的生物合成可能有助于真菌細(xì)胞維持細(xì)胞內(nèi)ROS 的安全水平。

雖然真菌毒素生物合成的調(diào)節(jié)與氧化應(yīng)激之間的聯(lián)系遠(yuǎn)未完全闡明，但是這種相互作用為工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物（例如抗生素）或控制作物中霉菌毒素的積累提供了廣闊的前景。例如，一些酚類的抗氧化劑通常在許多植物（包括谷物）中大量存在，這些抗氧化劑可以負(fù)調(diào)節(jié)毒素生產(chǎn)[52]。控制這些抗氧化劑在作物中的含量，可能有助于調(diào)控食物和飼料中霉菌毒素。

5 總結(jié)與展望

曲霉屬真菌在自然界中分布廣泛，是人、動物及植物的共同病原菌，其產(chǎn)生的毒素污染不僅制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，而且產(chǎn)生嚴(yán)重的食品安全問題。群體感應(yīng)分子機(jī)制可以調(diào)節(jié)曲霉屬真菌的生長發(fā)育和次級代謝，然而目前對曲霉屬真菌的群體感應(yīng)研究仍然處于初級的階段，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)的信號分子、受體、下游調(diào)控通路的靶分子等仍然不清晰。目前發(fā)現(xiàn)的曲霉屬真菌群體感應(yīng)的信號分子主要是脂氧合物，其受體是G 蛋白偶聯(lián)受體 （GPCRs），G 蛋白信號通路基因的突變影響孢子形成和霉菌毒素的產(chǎn)生。不飽和脂肪酸通過脂氧合酶 （LOX） 的催化產(chǎn)生脂氧合物，lox 和ppo 可以編碼合成加氧酶類及脂氧合物，具有調(diào)控曲霉屬真菌生長發(fā)育和產(chǎn)毒的作用。氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)與真菌毒素生物合成之間有密切的聯(lián)系，真菌可能通過合成毒力因子來應(yīng)對活性氧水平的升高，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白質(zhì)可協(xié)調(diào)氧化應(yīng)激與次級代謝之間的相互作用。

目前仍然存在一些值得深究的問題。①曲霉屬真菌的群體感應(yīng)現(xiàn)象是否與氧化應(yīng)激水平有關(guān)？真菌毒素的生物合成與群體感應(yīng)、氧化應(yīng)激均相關(guān)，這三者間的關(guān)系及這些現(xiàn)象之下的生物學(xué)機(jī)制如何仍然不清楚。②曲霉屬真菌在與植物寄主互作過程中，是如何利用寄主的脂氧合物（作為信號分子）和應(yīng)對寄主升高的氧化應(yīng)激壓力？植物對真菌的入侵有抵抗防御的能力，其中升高其體內(nèi)活性氧水平可能是機(jī)制之一；而真菌也會進(jìn)化出有利于其自身生存的抵抗機(jī)制，其可能通過合成一些次級代謝產(chǎn)物（如真菌毒素）來適用寄主的氧化應(yīng)激壓力。這些問題的解答將有助于人們加深對曲霉屬真菌毒素生物合成機(jī)制及其生物學(xué)意義的理解，能夠?yàn)檠芯靠刂萍Z食中的真菌毒素的生物合成的抑制劑提供靶向信號通路或靶分子。