土鱉蟲抗兔高膽固醇血癥模型內(nèi)參基因的評(píng)估及應(yīng)用

張 震，姜恩澤，寧方勇，杜智恒，白秀娟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）高效、靈敏、特異性強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于分子診斷、生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域[1]。樣品獲得和處理、RNA質(zhì)量和完整性、反轉(zhuǎn)錄、PCR效率等影響qPCR結(jié)果[2]。因此，qPCR分析數(shù)據(jù)需標(biāo)準(zhǔn)化處理以提高結(jié)果準(zhǔn)確性[3]。一般以穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)參基因作為內(nèi)源性對(duì)照[4]。理想內(nèi)參基因，在組織類型和試驗(yàn)中必須穩(wěn)定表達(dá)。研究表明，內(nèi)參基因（Gapdh和Actb等）在不同物種、組織類型、細(xì)胞系、發(fā)育階段和試驗(yàn)中非恒定表達(dá)，不存在理想通用內(nèi)參基因[5-6]。因此，依據(jù)不同條件選擇合適內(nèi)參基因，對(duì)qPCR分析結(jié)果準(zhǔn)確性十分重要。

高膽固醇血癥（Hypercholesterolaemia）屬于血脂異常癥，表現(xiàn)為血清總膽固醇水平（TC）偏高，引起動(dòng)脈粥樣硬化、誘發(fā)心肌梗死、中風(fēng)和腦卒中等疾病，應(yīng)高度重視高膽固醇血癥預(yù)防和治療[7]。目前，高膽固醇血癥治療藥物主要為他汀類、貝特類等西藥，作用單一，易引起不良反應(yīng)，副作用較強(qiáng)。中藥治療優(yōu)點(diǎn)為藥源豐富、不良反應(yīng)小、多靶點(diǎn)等，降膽固醇類中藥研究日益增多。土鱉蟲（Eupolyphaga steleophaga）是傳統(tǒng)中藥，為鱉蠊科（Corydiidae）昆蟲地鱉（Eupolyphaga sinensis Walker）或冀地鱉（Steleophaga plancyi Boleny）雌蟲干燥體。趙德忠、王征等報(bào)道土鱉蟲可調(diào)節(jié)肥胖大鼠血脂[8-9]；趙志壯等應(yīng)用qPCR技術(shù)進(jìn)一步探討土鱉蟲凍干粉治療高脂血癥家兔作用機(jī)制[10]。應(yīng)用qPCR技術(shù)可加快土鱉蟲抗膽固醇藥理作用分子機(jī)制研究，但目前尚無該模型相關(guān)內(nèi)參基因評(píng)估。本文旨在使用5種不同算法GeNorm,BestKeeper,NormFinder，ΔCt和RefFinder評(píng)估9個(gè)常用內(nèi)參基 因（Actb、B2m、Eef1a1、Gapdh、Hprt1、Ppia、Rpl5、Sdha、Ywhaz）在土鱉蟲抗兔高膽固醇血癥模型肝臟中表達(dá)穩(wěn)定性，為該模型提供合適內(nèi)參基因；應(yīng)用最穩(wěn)定內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表達(dá)，從分子水平研究土鱉蟲調(diào)節(jié)膽固醇機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

60只2月齡雄性哈白兔，體重（2.0±0.25）kg，購(gòu)自華強(qiáng)皮草開發(fā)有限公司。

1.2 主要儀器

7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）；離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外分光光度計(jì)和高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自Eppendorf（中國(guó)）有限公司。

1.3 藥物與試劑

土鱉蟲粉購(gòu)自黑龍江省哈爾濱市中藥材大市場(chǎng)；組織RNA提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒，購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。

1.4 分組、模型制備和樣品采集

單籠飼養(yǎng)、自由飲水預(yù)飼基礎(chǔ)飼料7 d后，60只雄性哈白兔隨機(jī)分為2組，空白組15只，飼喂基礎(chǔ)飼料；高膽固醇血癥組45只，飼喂高膽固醇飼料（79%基礎(chǔ)飼料+1%膽固醇+10%豬油+10%蛋黃粉），制備高膽固醇血癥兔，制備期8周。每2周稱重1次，每組隨機(jī)抽取5個(gè)樣本檢測(cè)12 h空腹血清膽固醇以監(jiān)測(cè)造模情況，8周結(jié)束時(shí)，檢測(cè)所有個(gè)體重和12 h空腹血清膽固醇。

將高膽固醇血癥兔隨機(jī)分為3組，對(duì)照組11只，高、低劑量給藥組各12只。高、低劑量給藥組分別飼喂含有0.4和0.2 g·kg-1土鱉蟲粉基礎(chǔ)飼料，空白組和對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，治療期6周。于治療期第3周，各組隨機(jī)抽取3只檢測(cè)12 h空腹血清膽固醇。治療結(jié)束時(shí)，分別取空白組、對(duì)照組和高、低劑量給藥組各10只檢測(cè)12 h空腹血清膽固醇，處死后迅速取肝組織分裝于凍存管置于液氮速凍，-80℃冰箱保存。

1.5 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

按OMEGA組織RNA提取試劑盒說明書提取肝組織總RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度并計(jì)算濃度。按全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為：總RNA 1μg，2×TSReaction Mix 10 μL，Anchored Oligo（dT）1 μL，Trans Script RT/RI Enzyme Mix 1μL，gDNA Remover 1μL，補(bǔ)足RNase-Free Water至20μL，混勻。反轉(zhuǎn)錄條件為：45℃30 min，85℃5 s。所獲cDNA 5倍稀釋后用于qPCR分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）分析

引物序列見表1。反應(yīng)體系10μL，包括：cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 5μL， Passive Reference DyeⅡ（50×）0.2μL，補(bǔ)足ddH2O至10μL。反應(yīng)條件為：50℃ 2 min；95℃ 30 s；（95℃ 5 s，60℃ 30 s）×40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s；60℃1 min;95℃30 s。每個(gè)樣品3次重復(fù)，Ct取平均值。

表1 引物序列和特點(diǎn)Table1 Primer sequences and character

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS24.0中ANOVA模型LSD法分析不同組間血清總膽固醇水平（TC）和膽固醇相關(guān)基因表達(dá)差異。使用GeNorm、BestKeeper、NormFinder、ΔCt和RefFinder算法評(píng)估內(nèi)參基因穩(wěn)定性。采用2-ΔΔCt法分析肝Lxrα、Abca1和Cyp7a1 基因相對(duì)表達(dá)比率。

GeNorm依據(jù)Ct值計(jì)算每個(gè)內(nèi)參基因（基因個(gè)數(shù)≥3）組內(nèi)配對(duì)變異值，該值為基因穩(wěn)定量度值（M值，M值＜0.5內(nèi)參基因較穩(wěn)定），M值為內(nèi)參基因穩(wěn)定值，M值越小內(nèi)參基因越穩(wěn)定。GeNorm配對(duì)分析標(biāo)準(zhǔn)化因子n（NFn）和標(biāo)準(zhǔn)化因子n+1（NFn+1），分析結(jié)果定義為Vn/n+1，當(dāng)Vn/n+1＜0.150時(shí)，最佳內(nèi)參基因數(shù)量為n，即無須使用n+1個(gè)內(nèi)參基因保證數(shù)據(jù)可靠性。）和NFn+1）分別代表n和n+1個(gè)M值幾何平均數(shù)，其中n為M值序列號(hào)[11]。BestKeeper依據(jù)Ct值描述性統(tǒng)計(jì)分析內(nèi)參基因（基因個(gè)數(shù)≤10），分析結(jié)果中標(biāo)準(zhǔn)偏差值（SD值＜1內(nèi)參基因較穩(wěn)定）為內(nèi)參基因穩(wěn)定值，SD值越小內(nèi)參基因越穩(wěn)定[12]。NormFinder依據(jù)Ct值計(jì)算每個(gè)內(nèi)參基因（基因個(gè)數(shù)≥8）組內(nèi)變異和組間變異，并將組內(nèi)變異和組間變異值合并，定義為內(nèi)參基因穩(wěn)定值，對(duì)應(yīng)內(nèi)參基因穩(wěn)定性，穩(wěn)定值越小內(nèi)參基因越穩(wěn)定[13]。ΔCt算法依據(jù)Ct值計(jì)算配對(duì)內(nèi)參基因（基因個(gè)數(shù)≥3）組內(nèi)平均標(biāo)準(zhǔn)偏差值（SD平均值），SD平均值為內(nèi)參基因穩(wěn)定值，值越小內(nèi)參基因越穩(wěn)定[14]。RefFinder依據(jù)以上4種算法計(jì)算每個(gè)內(nèi)參基因幾何平均數(shù)加權(quán)值（GM值），GM值為內(nèi)參基因穩(wěn)定值，值越小內(nèi)參基因越穩(wěn)定[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 各階段血清總膽固醇（TC）水平

共制備高膽固醇血癥兔35只，空白組（n=15）與高膽固醇血癥型組（n=35）差異極顯著（P＜0.01），表明制備成功。治療結(jié)束時(shí)，空白組（n=10），高（n=10）、低（n=10）劑量給藥組與對(duì)照組（n=10）差異極顯著（P＜0.01），各給藥組與空白組差異不顯著（P>0.05），各給藥組間差異不顯著，表明2種土鱉蟲劑量均可降低血膽固醇（見表2）。

表2 土鱉蟲對(duì)高膽固醇血癥兔血清總膽固醇的影響Table2 Effectsof eupolyphaga on total cholesterol of rabbitswith hypercholesterolaemia (mmol·L-1)

2.2 肝臟中內(nèi)參基因穩(wěn)定性

肝臟中5種算法評(píng)估9個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性見表3，確定各種算法中4個(gè)最穩(wěn)定內(nèi)參基因。GeNorm評(píng)估4個(gè)最穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)椋築2m=Ywhaz>Ppia>Eef1a1，BestKeeper評(píng)估4個(gè)最穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)椋築2m>Ywhaz>Ppia>Eef1a1，NormFinder評(píng)估 4個(gè)最穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)椋篏apdh>Sdha>Eef1a1>Ppia，ΔCt評(píng)估4個(gè)最穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)椋篏apdh>Eef1a1>Sdha>Ppia，RefFinder評(píng)估4個(gè)最穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)椋篏apdh>B2m>Ywhaz>Eef1a1。結(jié)果表明，每種算法評(píng)估最穩(wěn)定內(nèi)參基因不同，BestKeeper和GeNorm評(píng)估結(jié)果中3個(gè)基因（B2m,Ywhaz,和Eef1a1）與RefFinder相同，ΔCt和NormFinder結(jié)果中2個(gè)基因（Gapdh和 Eef1a1）與RefFinder相同。5種算法中Hprt1、Actb和Rpl5均為不穩(wěn)定內(nèi)參基因，表明其在模型中表達(dá)不穩(wěn)定，不適合標(biāo)準(zhǔn)化該模型qPCR數(shù)據(jù)。

綜上分析，5種算法結(jié)果差異較小，整體趨勢(shì)接近一致。綜合各算法結(jié)果，4個(gè)較穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)椋篏apdh、B2m、Ywhaz和Eef1a1，3個(gè)最不穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)椋篐prt1、Actb和Rpl5。

表3 肝臟中五種算法評(píng)估結(jié)果Table 3 Evaluation results of reference genes by fivedifferent algorithmsin theliver

2.3 肝臟中最穩(wěn)定內(nèi)參基因

GeNorm計(jì)算配對(duì)變異Vn/n+1值并比較給定閾值0.150，確定最佳內(nèi)參基因數(shù)量。肝臟中配對(duì)變異Vn/n+1值見圖1。結(jié)果顯示，肝臟中所有Vn/n+1值均小于0.150，表明n取最小值即滿足算法，因此肝臟中最佳內(nèi)參基因數(shù)量為2。

綜合內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序和最佳內(nèi)參基因數(shù)量，肝臟中最穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)镚apdh和B2m。

2.4 土鱉蟲對(duì)肝Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表達(dá)的影響

使用Gapdh和B2m標(biāo)準(zhǔn)化肝Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表達(dá)結(jié)果見表4。

圖1 GeNorm確定4種組織中最佳內(nèi)參基因數(shù)Fig.1 Determination of the optimal number of referencegenesin thefour tissues using the GeNorm algorithm

表4 肝Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表達(dá)水平Table 4 Expression level of Lxrα、Abca1 and Cyp7a1 in liver

肝LxrαmRNA表達(dá)水平，對(duì)照組與其他組差異顯著（P＜0.05），各給藥組與空白組差異不顯著（P>0.05），給藥組間差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明，土鱉蟲可上調(diào)高膽固醇血癥兔肝LxrαmRNA表達(dá)，上調(diào)效果高劑量略高于低劑量。

肝Abca1 mRNA表達(dá)水平，對(duì)照組與其他組差異顯著（P＜0.05），各給藥組與空白組差異顯著（P＜0.05），給藥組間差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明，土鱉蟲可上調(diào)高膽固醇血癥兔Abca1 mRNA表達(dá)，上調(diào)效果高低劑量接近一致。

肝Cyp7a1 mRNA表達(dá)水平，對(duì)照組與其他組差異顯著（P＜0.05），高劑量給藥組與空白組差異不顯著（P>0.05），低劑量給藥組與空白組差異顯著（P＜0.05），給藥組間差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明，土鱉蟲可上調(diào)高膽固醇血癥兔肝Cyp7a1 mRNA表達(dá)，上調(diào)效果高劑量略高于低劑量。

3 討 論

正常兔血漿膽固醇水平較低，對(duì)飼料中膽固醇敏感，飼喂含0.3%～2%膽固醇和4%～8%脂肪飼料4周后，血漿膽固醇水平快速提升[16]。因此，兔成為降脂藥物研究重要試驗(yàn)動(dòng)物[17-18]。本研究中，哈白兔血清膽固醇水平快速提升，可用于制備高膽固醇血癥兔模型，但制備成功率未達(dá)100%，可能為環(huán)境、年齡、品系等因素造成[19]。王玉明等研究發(fā)現(xiàn)，土鱉蟲可降低高脂血癥小鼠血清膽固醇濃度[20]；張晶等在Ⅱ型糖尿病大鼠研究中也得到類似結(jié)果[21]。本研究結(jié)果顯示，給藥組與對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），表明高、低劑量土鱉蟲粉均可降低高膽固醇血癥兔血清膽固醇，與白秀娟等研究結(jié)果相似[22]。

qPCR是檢測(cè)基因表達(dá)重要技術(shù)，選擇穩(wěn)定內(nèi)參基因可保證qPCR結(jié)果準(zhǔn)確，組織類型和試驗(yàn)條件影響內(nèi)參基因穩(wěn)定性。Nachar等研究表明，不同內(nèi)參基因在兔左心室舒張功能紊亂模型中穩(wěn)定性不同[23]；陳瑞等研究表明，兔不同發(fā)育階段和組織最穩(wěn)定內(nèi)參基因不同[24]。本研究結(jié)果表明，不同內(nèi)參基因在模型肝臟中穩(wěn)定性不同，Gapdh、B2m、Ywhaz和Eef1a1較Hprt1、Actb和Rpl5更穩(wěn)定。不同算法評(píng)估內(nèi)參基因穩(wěn)定性存在差異。Almeida-Oliveira等研究表明，在高膽固醇血癥小鼠脂肪組織中，GeNorm、BestKeeper、NormFinder、ΔCt和RefFinder算法評(píng)估內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果不同[25]。5種算法結(jié)果差異原因?yàn)樗惴ㄔ聿煌?，GeNorm和ΔCt為組內(nèi)變異比較；BestKeeper為簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)描述；NormFinder為組內(nèi)組間變異比較；RefFinder為幾何平均數(shù)加權(quán)計(jì)算，不具有生物學(xué)意義。本研究中，盡管5種算法評(píng)估內(nèi)參基因結(jié)果不同，但差異較小，表明各算法評(píng)估結(jié)果均具有一定準(zhǔn)確性，綜合5種算法結(jié)果更準(zhǔn)確，與Almeida-Oliveira等評(píng)估結(jié)果一致[26]。為提高試驗(yàn)效率，計(jì)算最佳內(nèi)參基因數(shù)量十分重要。Vandesompele等研究表明，最佳內(nèi)參基因數(shù)量不可小于2個(gè)[11]。GeNorm可確定試驗(yàn)所需最佳內(nèi)參基因數(shù)且數(shù)量不小于2個(gè)，董曉麗等使用GeNorm確定免疫刺激后小鼠肝臟最佳內(nèi)參基因數(shù)量為2個(gè)[26]。本研究中，適用模型肝臟最佳內(nèi)參基因數(shù)量為2個(gè)，符合最佳內(nèi)參基因數(shù)量要求。綜合5種算法，土鱉蟲抗哈白兔高膽固醇血癥模型肝臟最穩(wěn)定2個(gè)內(nèi)參基因?yàn)镚apdh和B2m，可保證qPCR數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性又兼顧時(shí)間、成本等因素，符合其試驗(yàn)研究發(fā)表最少信息指南（MIQE指南）[2]推薦策略。

探討土鱉蟲調(diào)節(jié)膽固醇機(jī)制，應(yīng)主要研究影響膽固醇代謝的關(guān)鍵基因。冷雪冰等研究表明，土鱉蟲可上調(diào)高血脂家兔Apo E和LDL-R基因表達(dá)量[27]；李洪萍等研究表明土鱉蟲凍干粉可下調(diào)高血脂肉兔肝臟SR-BI基因表達(dá)[28]。目前，尚無其他相關(guān)基因表達(dá)研究。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（Abca1）為膜轉(zhuǎn)運(yùn)體ABC家族成員，高表達(dá)于肝腎等組織，主要功能為調(diào)控胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外和高密度脂蛋白（HDL）產(chǎn)生，加快胞內(nèi)膽固醇外排而降低胞內(nèi)膽固醇濃度[29]。細(xì)胞色素7A1（Cyp7a1）酶是一種微粒酶，僅在肝臟中表達(dá)，為催化膽汁酸經(jīng)典合成途徑限速酶，Cyp7a1基因表達(dá)提高后，增強(qiáng)膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化，降低體內(nèi)膽固醇累積[30]。肝X受體α（Lxrα）為核受體家族Lxrs亞型之一，高表達(dá)于肝臟等組織，可調(diào)控Abca1和Cyp7a1基因表達(dá)，為調(diào)節(jié)肝臟膽固醇代謝重要基因[31]。本研究結(jié)果表明，治療結(jié)束時(shí)，與模型組比較，各給藥組均可顯著上調(diào)Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表達(dá)（P＜0.05），與白秀娟等[32]發(fā)現(xiàn)土鱉蟲可上調(diào)高血脂癥家兔HDL類似，表明提高膽固醇外排和轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)可能為土鱉蟲治療高膽固醇血癥分子機(jī)制。土鱉蟲成分復(fù)雜，其調(diào)節(jié)膽固醇分子機(jī)制尚待深入。

4 結(jié)論

哈白兔可制備土鱉蟲抗兔高膽固醇血癥模型；5種算法綜合評(píng)估該模型肝臟最穩(wěn)定2個(gè)參基因?yàn)镚apdh和B2m，為應(yīng)用qPCR技術(shù)深入研究該模型機(jī)制奠定基礎(chǔ)；土鱉蟲調(diào)控膽固醇機(jī)制可能與上調(diào)Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表達(dá)有關(guān)。