牛棒狀桿菌檢測團體標準的編制

邢 進，馮育芳，張雪青，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 102629)

牛棒狀桿菌(Corynebacteriumbovis，Cb)是一種革蘭氏陽性短桿菌，是牛乳房炎的主要病原之一[1]。日本、美國及歐洲都有裸鼠感染的報道[2]，Cb也可以感染人，主要存在于結(jié)膜和皮膚，常引起眼部感染[3]。近年來隨著國內(nèi)生物制藥和醫(yī)學(xué)研究的快速發(fā)展，動物進口也增加了Cb引入的風(fēng)險[4]。在實驗動物中，該菌主要感染免疫缺陷小鼠，但多不表現(xiàn)出臨床癥狀，主要引起裸鼠過度角質(zhì)化癥(hyperkeratosis)，致裸鼠發(fā)生過度角質(zhì)化皮炎和棘皮癥[5]。裸鼠作為一種免疫缺陷動物，已成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)研究領(lǐng)域中不可缺少的實驗動物模型，在腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥品和生物制品的安全性評價及藥物篩選等方面具有特殊的應(yīng)用價值。

1 編制背景

目前，我國尚無Cb相關(guān)檢測標準頒布。為了適應(yīng)現(xiàn)階段的檢測需求，有效檢測和排除Cb的污染，填補實驗動物檢測標準上的空白，制定該菌檢測的標準勢在必行。本文對“實驗動物 牛棒狀桿菌檢測方法”團體標準的編制和初步應(yīng)用情況進行詳細的說明，推動本標準能夠有效的實施，為Cb的檢測和控制提供依據(jù)。

2 法規(guī)依據(jù)

《實驗動物管理條例》(中華人民共和國國家科學(xué)技術(shù)委員會令第2號)第十六條規(guī)定，“對引入的實驗動物，必須進行隔離檢疫?！钡谑艞l規(guī)定，“應(yīng)用不合格實驗動物取得的檢定或者安全評價結(jié)果無效，所生產(chǎn)的制品不得使用?！钡诙鍡l規(guī)定，“進口、出口實驗動物的檢疫工作，按照《中華人民共和國進出境動植物檢疫法》的規(guī)定辦理”[6]。其中包括第二十七條，“進口動物產(chǎn)品經(jīng)檢疫發(fā)現(xiàn)有檢疫對象和應(yīng)檢疫病的，簽發(fā)《檢疫處理通知單》，通知并監(jiān)督報檢人按下列原則處理，……(二)對無法有效消毒的產(chǎn)品，做整批退回或銷毀處理?！钡谌鶙l，“輸往與國簽訂動植物檢疫雙邊協(xié)定的國家的動植物產(chǎn)品，應(yīng)按協(xié)定中規(guī)定的檢疫要求檢驗；……”[7]。因此，對于實驗動物這種特殊的動物產(chǎn)品而言，感染Cb的動物勢必會對動物設(shè)施[8]及后期的飼養(yǎng)繁育[9]和動物實驗[10]等操作帶來直接的影響。本標準的制定為實驗動物牛棒狀桿菌的檢測提供了重要依據(jù)。

《實驗動物質(zhì)量管理辦法》(國科發(fā)財字[1997]593號)中第二十條規(guī)定，“國家實驗動物質(zhì)量檢測機構(gòu)是實驗動物質(zhì)量檢測、檢驗方法和技術(shù)的研究機構(gòu)，實驗動物質(zhì)量檢測人員的培訓(xùn)機構(gòu)和具有權(quán)威性的實驗動物質(zhì)量檢測服務(wù)機構(gòu)。其主要任務(wù)是：開展實驗動物及相關(guān)條件的檢測方法、檢測技術(shù)研究”[11]。面對檢測Cb的需求，作為檢測機構(gòu)有義務(wù)及時建立檢測方法，解決無標可依的情況。

3 編制內(nèi)容

3.1 分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)是細菌檢測的經(jīng)典方法，能夠直接分離獲得病原菌并進行鑒定，結(jié)果準確。Cb屬需氧菌，在血瓊脂上生長良好，但生長比較緩慢。采用分離培養(yǎng)的方法檢測Cb無需特殊設(shè)備，簡單易行。

3.1.1 樣品采集

待檢樣品宜采取活體或剛死亡動物的皮膚拭子、腸內(nèi)容物、新鮮糞便或病灶分泌物?；铙w采樣時，可將無菌棉簽用滅菌生理鹽水濕潤，輕輕擦拭皮膚表面，以疑似鱗屑分泌物覆蓋處為主要部位，或采取新鮮的糞便，接種于血瓊脂平皿上，置36℃培養(yǎng)48 h。如處死動物，則根據(jù)國家標準[12]的操作，取盲腸內(nèi)容物，接種于血瓊脂平皿上培養(yǎng)。同時可將皮膚拭子、新鮮糞便或回盲內(nèi)容物混懸于無菌PBS中，以備提取基因組DNA。

3.1.2 生化鑒定

Cb在血瓊脂上形成1 mm左右、灰白色、凸起、無光澤、不溶血的菌落。檢測時應(yīng)首先關(guān)注血平皿上的特征可疑菌落，根據(jù)目前國家標準中的檢測項目[13]，與Cb菌落形態(tài)相似的只有鼠棒狀桿菌(Ck)，但相比Cb，Ck菌落顏色似石灰，凸起更為明顯，觸感較硬，涂片不易乳化。對血平皿上生長出的可疑菌落應(yīng)用接種環(huán)小心挑取，再次接種于血瓊脂平皿傳代純化，置36℃再次培養(yǎng)48 h。對純培養(yǎng)菌落需進行生化鑒定以確定是否符合Cb的生化特征。生化鑒定項目的確定主要依據(jù)兩個方面：①伯杰細菌手冊，參考其中對棒狀桿菌屬各菌株的鑒別生化項目[14]；②便于獲得試劑及操作的生化鑒定項目。Cb的生化特征主要為：氧化酶陽性，堿性磷酸酶、吡嗪酰胺酶陽性[15]，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、甘露醇、七葉苷、硝酸鹽還原、CAMP反應(yīng)均為陰性，尿素酶根據(jù)菌株來源的不同會存在差別[16]。

3.2 熒光定量PCR

對病原菌的快速檢測離不開分子生物學(xué)方法，目前已經(jīng)報道的應(yīng)用與Cb的分子生物學(xué)方法主要有普通PCR[5]、熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR)[16 - 17]、16SrDNA測序[18 - 19]和質(zhì)譜檢測方法[20]，其中16SrDNA的方法最為準確[21]，但檢測成本和時間相比qPCR沒有優(yōu)勢，因此目前qPCR是最理想的檢測方法。

細菌的16SrRNA V3區(qū)具有高度的差異性，是非常理想的探針設(shè)計區(qū)域[22]。qPCR方法通過兩條標記熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團的引物對牛棒狀桿菌16SrDNA的V3區(qū)進行擴增，當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。所發(fā)出的熒光信號可以被熒光定量PCR儀所記錄捕捉。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累，熒光強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。據(jù)此片段設(shè)計MGB熒光定量PCR引物和探針，可對皮膚、口腔、腸內(nèi)容物或糞便樣品進行熒光定量PCR檢測。

4 實施難點

4.1 可疑菌落的挑選

Cb在血瓊脂上形成1 mm左右、白色無光澤、不溶血的菌落。因此在初代培養(yǎng)時，Cb的可疑菌落容易被忽視，要求檢測人員細致觀察有無細小的菌落存在。經(jīng)過純傳后Cb一般才會顯現(xiàn)出其典型的菌落特征。

4.2 生化鑒定項目實施

氧化酶試劑，葡萄糖、甘露醇糖醇類培養(yǎng)基及硝酸鹽、尿素等培養(yǎng)基屬于常規(guī)生化鑒定項目，比較容易操作；CAMP反應(yīng)需要有β溶血的金黃色葡萄球菌和B群溶血性鏈球菌作為試驗用菌株，其原理是具有CAMP因子的細菌能夠促進金黃色葡萄球菌β溶血素活性，從而在血瓊脂上呈現(xiàn)出箭頭狀溶血區(qū)；堿性磷酸酶試驗和吡嗪酰胺酶試驗操作相對復(fù)雜，堿性磷酸酶試驗原理是，堿性磷酸酶是底物專一性較低的非特異性磷酸單酯酶，能催化磷酸單酯的水解反應(yīng)產(chǎn)生無機磷酸和的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無機磷酸和相對應(yīng)的醇、酚或糖，在相應(yīng)的基質(zhì)液中可顯出不同的顏色[23 - 24]；吡嗪酰胺酶試驗是Cb具有吡嗪酰胺水解酶活力，可將吡嗪酰胺轉(zhuǎn)化為殺菌的吡嗪酸，當加入硫酸亞鐵銨后，可與吡嗪酰胺水解酶發(fā)生顯色反應(yīng)，它是棒狀桿菌屬鑒別的關(guān)鍵項目之一[25]。某些自動細菌鑒定儀或試劑盒可檢測堿性磷酸酶，吡嗪酰胺酶試驗則需要單獨購買吡嗪酰胺和硫酸亞鐵銨手工鑒定。

4.3 結(jié)果的判定

4.3.1 生化鑒定結(jié)果判定的前提是確保生化試劑的有效性

每次生化鑒定須設(shè)置陰性、陽性對照來驗證相對應(yīng)生化試劑的合格有效。隨著自動細菌鑒定設(shè)備和試劑盒的出現(xiàn)，簡化了細菌生化鑒定操作，也避免了實驗人員主觀判斷帶來的誤差。但在缺少此類設(shè)備時，仍要求檢測人員能夠依據(jù)相關(guān)生化項目準確鑒定可疑Cb。在棒狀桿菌屬中，乳房炎棒狀桿菌(Corynebacterium mastitidis)的生化鑒定常與Cb相混淆，此時宜采用PCR方法進行驗證，避免得出錯誤結(jié)論。

Cb基本不發(fā)酵糖醇類培養(yǎng)基，當遇到有些反應(yīng)遲緩的非Cb菌株，容易造成混淆和誤判。此外，因為菌株來源的不同，尿素會出現(xiàn)陰陽不定的情況。一般嚙齒類來源的Cb菌株，尿素酶一般為陽性，而牛來源的菌株則為陰性。因此這種結(jié)果屬于正常情況，通過此特點，可大致判斷菌株的污染途徑。

4.3.2 qPCR結(jié)果的判定同樣需要在陰、陽對照成立的情況下判定

4.4 設(shè)備環(huán)境要求

Cb屬于生物安全2級病原微生物，對Cb的檢測首先應(yīng)具備生物安全2級實驗室的實驗條件。采用分離培養(yǎng)的方法檢測Cb無需特殊設(shè)備，36℃恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜、顯微鏡即可滿足檢測需求。有條件的實驗室使用自動細菌鑒定儀能夠極大的提高檢測的準確率和檢測效率。采用qPCR方法檢測必須使用熒光定量PCR儀實時監(jiān)測擴增曲線。此類設(shè)備購買和使用成本較高，須定期維護和檢定，以保證所得結(jié)果的準確、有效。

4.5 檢測成本

本標準制定了分離培養(yǎng)和qPCR方法，除了考慮實驗設(shè)備的普及程度外，還兼顧檢測成本因素。分離培養(yǎng)法和qPCR法相比較，檢測成本花費由低至高依次為：國產(chǎn)生化試劑、qPCR、Vitek2自動細菌鑒定系統(tǒng)、API棒狀桿菌試紙條。相比而言，qPCR在檢測效率、準確性和經(jīng)濟角度是比較理想的選擇。另外對檢測機構(gòu)而言，有限的檢測數(shù)量無疑會帶來檢測試劑的浪費，從而增加檢測成本。找到檢測方法、常備檢測試劑和檢測數(shù)量的平衡點至關(guān)重要。

5 討論

經(jīng)過多家檢測實驗室的驗證，證明本標準適用于牛棒狀桿菌的實驗室檢測，解決了現(xiàn)階段國內(nèi)牛棒狀桿菌檢測無標準可循的狀態(tài)。

qPCR技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強等優(yōu)點在基因表達水平分析、突變和多態(tài)性研究、病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛應(yīng)用。Taqman MGB探針相比普通Taqman探針可設(shè)計的更短，不僅降低成本，也提高了保守區(qū)內(nèi)搜尋特異探針的成功率。其經(jīng)過了化學(xué)修飾，提高了Tm值，使反應(yīng)的結(jié)果更精確，分辨率更高[26]。

牛棒狀桿菌可存在于口腔和消化道，可采集咽拭子和糞便作為日常監(jiān)測樣品。根據(jù)實際檢測結(jié)果，當裸鼠表現(xiàn)出臨床癥狀時，皮膚拭子的結(jié)果拷貝數(shù)高于回盲內(nèi)容物約100倍。當動物皮膚出現(xiàn)黃白色鱗片狀分泌物附著于皮膚表面時，宜采取皮膚樣品。

細菌的生化鑒定結(jié)果的陰性或陽性是指絕大多數(shù)菌株的反應(yīng)結(jié)果，并不能代表所有菌株。為了保證標準的可操作性，標準中所列Cb生化鑒定項目僅有12項。在實際檢測中，很可能遇到結(jié)果不一致的情況，此時仍需qPCR及臨床表現(xiàn)綜合判定結(jié)果。受限于已知參考菌株序列的限制，qPCR的探針引物不可能涵蓋所有Cb菌株，或是區(qū)分所有其他棒狀桿菌。隨著檢測的逐步開展，本標準中的生化項目和qPCR方法也將適時更新和完善。

6 未來展望

從細菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定到qPCR檢測，都存在各自的優(yōu)缺點，沒有任何一種方法能夠做到盡善盡美。全基因組測序技術(shù)是獲得微生物全部遺傳信息的最佳途徑。在基因組測序如火如荼發(fā)展的今天，測序費用已越來越低，技術(shù)也越來越成熟。在大數(shù)據(jù)分析及數(shù)據(jù)共享的環(huán)境下，期待測序技術(shù)能夠應(yīng)用于實驗動物病原菌的檢測。