端粒酶及其與疾病的關(guān)系概述

梁麗琴 任盼盼

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 臨汾 041000)

早在20世紀30年代科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)DNA末端存在一段高度重復(fù)的非編碼序列，并將其命名為端粒。端粒結(jié)構(gòu)使DNA末端免于被核酶水解。然而，DNA聚合酶無法將DNA完全復(fù)制，每復(fù)制一次DNA末端會丟失大約一個岡崎片段所含的堿基對數(shù)，這一機制使細胞不可能無限制地復(fù)制，因此端粒長短決定著細胞和個體的壽命。保持端粒長度需要另一種酶——端粒酶，這種酶在1989年首次被發(fā)現(xiàn)。在端粒酶的催化下，通過逆轉(zhuǎn)錄途徑合成端粒DNA，從而延長端粒，允許細胞進行更多次復(fù)制。

1 端粒的結(jié)構(gòu)與功能

端粒是DNA末端一段多鳥嘌呤的重復(fù)序列，其長度和序列構(gòu)成具有種屬特異性。例如，人類初始端粒長度約15 kb，重復(fù)序列為5′-TTAGGG-3′。端粒末端形成T-環(huán)結(jié)構(gòu)、D-環(huán)結(jié)構(gòu)或者G四聯(lián)體高級結(jié)構(gòu)，并與端粒結(jié)合蛋白復(fù)合體Shelterin結(jié)合使其更加穩(wěn)定。端粒具有保護染色體的作用，可以防止DNA末尾相融合，防止DNA雙鏈斷裂，保持基因組的完整性[1]。

由于DNA復(fù)制的特殊機制，端粒隨細胞分裂損耗，一旦其縮短到特定長度，細胞便無法啟動復(fù)制，走向衰老和凋亡，即Hayflick極限。所以端粒長度決定個體壽命，并與細胞復(fù)制型衰老相關(guān)，被稱為“生命時鐘”。此外，端粒與人體健康密切相關(guān)，端?？s短會增加心血管疾病、肝硬化、高血壓、動脈粥樣硬化、骨髓衰竭、糖尿病和癌癥等的發(fā)生風(fēng)險[2]。

許多因素諸如環(huán)境、飲食、生活方式以及遺傳等均會影響端粒長度?？諝馕廴?、吸煙、壓力、炎癥、氧化應(yīng)激、紫外線及毒性重金屬等都會損傷端粒DNA[3]，導(dǎo)致端粒丟失或不穩(wěn)定；而富含類胡蘿卜素、輔酶Q10、硒及維生素D等抗氧化劑的食物則可以起到保護端粒的作用；母親所經(jīng)歷的壓力可以通過胎盤對胎兒產(chǎn)生跨代影響，使其端?？s短。

2 端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能

端粒酶是一種核糖核酸-蛋白復(fù)合物(RNP)，包括端粒酶RNA(TR)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和相關(guān)蛋白。端粒酶活性由TERT實現(xiàn)。TERT包含四個保守結(jié)構(gòu)域： 端粒酶必需N-末端結(jié)構(gòu)域(TEN)、端粒酶RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TRBD)、逆轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域(RT)和C-末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CTE)[4]。TERT又可分為幾個子區(qū)域，如： 末端RNA(TER)、TER模板邊界元素(TBE)、模板和模板識別元素(TRE)、RNA結(jié)合域(RBD)、手指域(IFD)和最新發(fā)現(xiàn)的伴隨TEN的RT-IFD連接區(qū)域(TRAP)等。許多端粒酶突變可歸因于TEN和TRAP的相互作用[5]。

在復(fù)制周期結(jié)束后，端粒酶以TR為互補模板、以dNTP為原料合成DNA末端重復(fù)序列，使端粒延長或復(fù)原。作用周期包括兩個階段： 第一階段是核苷酸的添加，即在3′末端依次逐個添加核苷酸，作用與聚合酶類似；第二個階段是模板再生，即在添加6個核苷酸之后，RNA模板從復(fù)合物上解離下來等待新一輪合成[6]。

3 端粒酶與疾病的關(guān)系

3.1 與癌癥的關(guān)系 人類的大多數(shù)體細胞不顯示端粒酶活性，少數(shù)分裂旺盛的細胞，如干細胞、生殖細胞、腫瘤細胞等呈人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)陽性。

端粒酶在80%～90%的癌癥中均有表達，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和皮膚癌。高活性端粒酶伴隨的細胞無控制生長，是癌癥的一個顯著標志。

除維持端粒長度使細胞永生外，hTERT在腫瘤發(fā)展過程中還具有誘導(dǎo)癌細胞的轉(zhuǎn)移、增加侵染性、抗凋亡和抗分化的作用[7]。TERT通過增加細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽/氧化葡萄糖胺比例減少由ROS誘導(dǎo)的細胞死亡，還可以激活核因子kB(NF-kB)通路抵抗細胞凋亡[8]。值得注意的是，癌細胞增殖能力與端粒酶活性直接相關(guān)，而與端粒長度無關(guān)。端粒酶過表達上調(diào)了整合素β的表達，而β1整合素(ITGB1)在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。TERT過表達促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，使癌細胞易于轉(zhuǎn)移[9]。

沒有任何證據(jù)證明端粒酶的激活足以直接誘導(dǎo)人類體細胞向癌細胞轉(zhuǎn)變，這可能表明端粒酶對于癌細胞產(chǎn)生并不是必需的，但癌癥發(fā)展的許多特性需要活性端粒酶，或通過端粒酶活化來獲得或維持。

3.2 與心血管疾病的關(guān)系 最近的數(shù)據(jù)表明，保留端粒酶活性是維持心血管平衡和預(yù)防心血管疾病的關(guān)鍵。老化的內(nèi)皮細胞(EC)和血管平滑肌細胞(VSMC)使血管內(nèi)側(cè)增厚，彈性喪失，并最終演化為動脈粥樣硬化。而臨床研究表明端粒酶的差異調(diào)節(jié)可以促進VSMC增殖，維持EC穩(wěn)態(tài)，TERT在線粒體表達可以消除血管內(nèi)活性氧(ROS)，起到延緩甚至逆轉(zhuǎn)衰老并恢復(fù)其生理功能的作用[10]。

3.3 與遺傳性骨髓衰竭綜合征的關(guān)系 遺傳性骨髓衰竭綜合征涉及多種疾病，包括范科尼貧血(FA)、先天性角化不良(DC)、Shwachman-Diamond綜合征(SDS)、先天性巨核細胞發(fā)育不良血小板減少癥(CAMT)和其他遺傳性疾病。FA和DC是最常見的再生障礙性貧血，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，患者體內(nèi)DNA非編碼區(qū)突變，造血干細胞端粒酶功能不全，酶活性隨著年齡增加下降明顯，與病程持續(xù)時間無關(guān)。某些家族性肝病如肝纖維化、隱源性肝硬化、非酒精性脂肪肝，與人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和人端粒酶RNA(hTR)的顯性突變有關(guān)，這些突變使端粒酶活性喪失[11]。

3.4 與慢性腎臟疾病的關(guān)系 通過對慢性腎臟疾病(CDK)患者的血液透析發(fā)現(xiàn)，患者的外周單核血細胞(PBMC)中端粒長度更短，端粒酶活性更低。且端粒酶活性受患者肥胖、炎癥等因素影響，與年齡性別無關(guān)[12]。

4 端粒酶介導(dǎo)的癌癥的診斷與治療

由于端粒酶在癌細胞永生中的中心作用，可以通過檢測端粒酶活性來定位癌細胞。如傳統(tǒng)的端粒重復(fù)擴增方案、近年來研發(fā)的與信號放大策略相結(jié)合的熒光方法、基于金納米顆粒的比色法、基于魯米諾的化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)端粒酶檢測(ECTA)，光穩(wěn)定成像法和化學(xué)發(fā)光法等[13]。通常，惡性腫瘤的端粒酶活性較高，故這些方法也可用于區(qū)分良性腫瘤與惡性腫瘤。

理想的癌癥治療希望在殺死癌細胞的基礎(chǔ)上對正常細胞的副作用最小。例如，通過特異性的針對端粒酶的治療來抵御腫瘤侵襲?，F(xiàn)有的方法包括： 小分子抑制劑、基因治療和免疫治療等。

化學(xué)抑制劑包括齊多夫定、雷帕霉素、阿司匹林、三氧化二砷及核素劑。植物來源的端粒酶抑制劑包括小檗堿、白藜蘆醇、紫檀芪、藤黃酸、飛薊素等。微生物源抑制劑包括從放線菌中分離出來的紅霉素、從鏈霉菌中分離的色拉霉素、從真菌中分離出來的二氮萘酸和CRM646-A(一種苯酚葡糖苷酸)等?；瘜W(xué)藥劑通過對端粒酶活性的抑制，有選擇地增加放射敏感性，從而殺死腫瘤細胞。

基因治療是利用反義寡核苷酸(單鏈DNA或RNA序列與端粒酶RNA互補)、小干擾RNA(雙鏈RNA分子降解mRNA或阻止翻譯)和核酶(裂解特定的基因)抑制端粒酶基因的表達[14]，如： 一種脂質(zhì)修飾的13-mer寡核苷酸(GRN163L)與端粒酶RNA基因(TERC)的模板互補可以阻止其表達，目前正在臨床醫(yī)學(xué)實驗階段。

抗端粒酶免疫治療是利用刺激自身免疫系統(tǒng)生成CD4+和CD8+兩種針對hTERT的T淋巴細胞，實現(xiàn)消滅腫瘤的目的?？捎靡呙缰饕校?GV1001、 GX301、 Vx-001-神經(jīng)肽疫苗及DNA疫苗。其中，GV1001疫苗是一種與hTERT有相同序列的短肽[15]，可用于治療晚期胰腺癌、非小葉細胞肺癌、黑色素瘤和其他癌癥，如與HR2822、 GM-CSF、 P540肽及莫替錯胺等疫苗聯(lián)合接種效果更佳；GX301疫苗是一種含有四種端粒酶肽的疫苗，對治療前列腺癌和腎癌有明顯療效[16]；Vx-001-神經(jīng)肽疫苗是一種低親和力的隱蔽性TERT肽，已完成了黑色素瘤、乳腺癌及膽管癌等的臨床試驗；DNA疫苗(如INACV-1)是一種編碼失活hTERT的質(zhì)粒DNA，可以有效觸發(fā)自身免疫，與肽疫苗相比更具成本效益。

5 總結(jié)和展望

端粒的發(fā)現(xiàn)及端粒酶工作機制的研究，將細胞衰老機制、某些疾病起源、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展機制的研究引入了一個新的方向。

端粒酶可以修復(fù)DNA復(fù)制造成的端粒損耗，通過在控制范圍內(nèi)激活端粒酶而使細胞保持分裂，理論上也是實現(xiàn)長壽的途徑之一。端粒酶在一些慢性病中的特征也表明端粒酶參與了這些疾病的形成，提供了早期診斷的新思路，有助于盡早確診。

大多數(shù)腫瘤細胞存在端粒酶活性異常增加的現(xiàn)象，是癌細胞的顯著特征之一。目前針對端粒酶的抗癌策略已被提出，但尚未進入大規(guī)模臨床應(yīng)用。藥物抑制端粒酶活性是可行之路，但用作抑制劑的小分子物質(zhì)一般對人體也有毒害作用，用量不適會對患者造成不可逆?zhèn)?；端粒酶基因沉默是DNA治療的主要手段，此方法依賴于高度發(fā)達的基因工程技術(shù)，目前為止尚不能通過此方法有效抑制所有癌細胞；針對端粒酶的自身免疫疫苗均為對人體無害的肽段或DNA片段，可以在抗癌同時真正做到對體細胞零傷害，此方法臨床效果也最佳，有待大規(guī)模推廣。深入研究端粒酶與癌細胞演化的關(guān)系，提出新的無害抗癌策略，研制新型特異性疫苗，有助于攻克千百年來的疑難雜癥，為患者帶來希望。