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    慢性束縛應(yīng)激對(duì)小鼠胃食管的影響

    2019-01-10 00:58:30買買提依斯熱依力吾布力卡斯木吾拉木艾克拜爾艾力李義亮阿孜古麗阿力木江阿麗葉古麗艾皮熱巴突爾艾克木蔣媛趙新勝阿卜杜薩拉木阿卜杜合力力克力木阿不都熱依木
    中華胃食管反流病電子雜志 2018年2期
    關(guān)鍵詞:束縛激素食管

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    隨著現(xiàn)代社會(huì)的快速發(fā)展,生活和工作壓力在無形中影響著人類的心身健康,同時(shí)也更加客觀地體現(xiàn)在一些生理疾病上,比如胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)。臨床研究報(bào)道焦慮、抑郁等精神因素可導(dǎo)致反流癥狀的加重[1];急性應(yīng)激可加重胃食管反流病患者的燒心癥狀[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí),心理或軀體應(yīng)激與胃腸道功能紊亂有密切的聯(lián)系,同樣在GERD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[3-4]。根據(jù)最新的流行病學(xué)研究報(bào)道,雖然GERD發(fā)病率在不同地區(qū)存在差異,但幾乎在所有地區(qū)呈逐年上升趨勢(shì)[5]。因此,GERD發(fā)病率的增加與日益受重視的心理因素之間的聯(lián)系有待深入研究。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠慢性束縛應(yīng)激(chronic restraint stress,CRS)模型,探討心理應(yīng)激所引起的下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸相關(guān)激素及胰島素分泌功能的變化及其對(duì)胃食管黏膜的組織學(xué)影響,為后期進(jìn)一步研究心理因素在GERD發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制提供理論依據(jù)。

    材料與方法

    一、一般材料

    1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:SPF級(jí)雄昆明小鼠25只,8周齡,購于新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,許可證號(hào):SCXK(新)2011-0001;飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所IVC系統(tǒng)動(dòng)物中心。25只小鼠進(jìn)行編號(hào)及體重測(cè)量,并排除體重變異較大的5只。采用Microsoft Office Excel軟件隨機(jī)分2組(各10只),即慢性束縛應(yīng)激(CRS)組和正常對(duì)照(normal control,NC)組。小鼠單只飼養(yǎng)在自由進(jìn)食水的鼠籠內(nèi),每日給予12 h晝夜循環(huán),光照均始于8∶30分,止于20∶30分

    2. 實(shí)驗(yàn)器材及主要試劑:自制式束縛器;電子天平(EL-5.2K),常州市天之平儀器設(shè)備有限公司;低溫高速離心機(jī)(1-14K),德國Sigma公司;光學(xué)顯微鏡(Eclipse E200),日本尼康公司;三諾安穩(wěn)血糖儀及血糖試條,三諾生物傳感股份有限公司;小鼠促腎上腺激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH),促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotrophic hormone,ACTH)、皮質(zhì)醇(Cortisol,CORT)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒,上海江萊生物科技有限公司;D-葡萄糖,德國Sigma公司;HE染色相關(guān)試劑,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    二、方法

    1. CRS模型的建立:正式實(shí)驗(yàn)前,將所有小鼠在相同環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。模型開始建立后,所有束縛應(yīng)激均在每日上午10∶30~12∶30(北京時(shí)間)進(jìn)行,以盡量減少生理周期的影響。10只CRS組小鼠置于用50 ml離心管所制的自制式束縛器中(離心管提前燙制出直徑約5 mm的通氣孔若干,分布于左右及上側(cè)管壁,管口塑料蓋做1小孔以暴露小鼠尾巴,圖1),每日限制活動(dòng)2 h,期間禁食禁水,后放回鼠籠內(nèi)自由活動(dòng),連續(xù)束縛14 d。NC組小鼠自由飲水?dāng)z食,其余時(shí)間2組小鼠處理相同。

    2. 取材與標(biāo)本處理:束縛應(yīng)激第14日下午17∶00(北京時(shí)間)開始對(duì)所有小鼠禁食,于次日11∶00(北京時(shí)間)進(jìn)行取材。將麻醉的動(dòng)物以平臥位固定,從腹部正中至劍突取切口取3 cm切口,下腔靜脈取血注入于1.5 ml EP管中。在距離胃食管交界處0.3和1.5 cm處剪斷取材,置于4%中性甲醛固定。

    3. 檢測(cè)血清中HPA軸相關(guān)激素的含量:取血后不經(jīng)任何處理,4 ℃下靜置2 h,之后以3500 rpm/min的速度低溫離心5 min,取上層血清,-80 ℃保存,用于后續(xù)血激素測(cè)定。ELISA法檢測(cè)HPA軸相關(guān)激素,即CRH、ACTH、CORT的含量。實(shí)驗(yàn)過程及測(cè)量指標(biāo)濃度的計(jì)算嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

    4. 葡萄糖耐受試驗(yàn)(GTT)與胰島素耐受試驗(yàn)(ITT):參照文獻(xiàn)進(jìn)行試驗(yàn),大體步驟如下:第14 d的束縛應(yīng)激結(jié)束后,所有小鼠需禁食16 h,可正常飲水,于第15 d取材前進(jìn)行試驗(yàn)[6-7]。GTT:試驗(yàn)開始前測(cè)血糖濃度,然后腹腔內(nèi)以2 g/kg的量注射D-葡萄糖,并在注射后30、60、90、120 min分別監(jiān)測(cè)血糖;ITT實(shí)驗(yàn):GTT試驗(yàn)結(jié)束后向小鼠腹腔內(nèi)注射胰島素0.75 U/Kg,其后分別在15、30、45、60 min分別檢測(cè)血糖并記錄。

    注:圖1.a:2組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)階段;b:2組小鼠束縛應(yīng)激開始前比較;c:2組小鼠束縛應(yīng)激結(jié)束后比較;d:2組小鼠應(yīng)激結(jié)束后大便形狀比較。NC為正常對(duì)照組;CRS組為慢性束縛應(yīng)激組

    圖1 慢性束縛應(yīng)激模型的建立過程

    a.ACTH促腎上腺皮質(zhì)激素 b.CRH促腎上腺激素釋放激素 c.Cortisol皮質(zhì)醇

    注:a為2組小鼠血清AcTH濃度比較;b為2組小鼠血清CRH濃度比較;c為2組小鼠血清Cortisol濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)NC為正常對(duì)照組;CRS組為慢性束縛應(yīng)激組;HPA為下丘腦-垂體-腎上腺

    圖2 CRS對(duì)HPA軸相關(guān)激素的影響

    5. 食管組織病理學(xué)檢查:4%中性甲醛固定24 h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋,制成5 μm厚切片行HE染色。切片質(zhì)量及食管、胃組織形態(tài)學(xué)改變均由富有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師診斷。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、CRS對(duì)小鼠體重和進(jìn)食量的影響

    體重為反應(yīng)小鼠機(jī)體整體狀況的基本指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)開始前CRS組小鼠體重為(25.0±1.6)g,NC組小鼠體重為(24.0±1.5)g,2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);14 d的實(shí)驗(yàn)過程中,CRS組小鼠平均每日進(jìn)食量為(13.5±1.3)g,顯著低于NC組(13.4±1.4)g,2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)結(jié)束后CRS組小鼠體重增加量為(8.6±3.1)g,NC組小鼠體重增加量為(12.5±3.0)g,2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CRS組小鼠異常的進(jìn)食量和體重增加量說明,實(shí)驗(yàn)組小鼠受到應(yīng)激的影響,機(jī)體一般狀況下降。

    注:NC為正常對(duì)照組;GTT為×××耐受試驗(yàn);CRS為慢性束縛應(yīng)激組;ITT為胰島素耐受試驗(yàn)

    二、CRS對(duì)小鼠血清HPA軸相關(guān)激素含量的變化

    小鼠在14 d的慢性應(yīng)激后,檢測(cè)血清中HPA軸相關(guān)激素(CRH、ACTH、CORT)水平發(fā)現(xiàn),CRS組小鼠的三種激素水平明顯高于NC組小鼠,2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖2)。

    三、CRS對(duì)小鼠糖耐量和胰島素耐量的變化

    GTT結(jié)果顯示,試驗(yàn)開始之初NC組和CRS組小鼠血糖上升明顯,并且2 h之內(nèi)恢復(fù)之前的濃度,提示2組小鼠未見糖耐量異常。ITT結(jié)果顯示,NC組小鼠血糖濃度有1次較大幅度的下降,2 h內(nèi)能夠恢復(fù)正常范圍內(nèi)的濃度;而CRS組小鼠的血糖雖然有下降,但2 h內(nèi)未能恢復(fù)到正常范圍之內(nèi),提示可能存在胰島素抵抗。經(jīng)計(jì)算曲線下面積得知,CRS組胰島素耐受在整體水平上與NC組小鼠具有顯著差異(P<0.05,圖3)。

    四、CRS對(duì)胃、食管黏膜組織學(xué)的影響

    HE染色鏡下觀察可見:食管粘膜層赤可見,基底細(xì)胞增生,固有層乳頭延長,中性粒細(xì)胞,淋巴細(xì)胞以及漿細(xì)胞浸潤,炎癥性改變(圖4),這些均為食管上皮受到外界因素?fù)p傷后的表現(xiàn)及增生修復(fù)反應(yīng)。但NC組未見明顯異常。

    討 論

    GERD作為全球范圍內(nèi)流行的消化道常見病,其在不同地區(qū)的發(fā)病率存在差異。根據(jù)最新的流行病學(xué)研究報(bào)道,在歐洲GERD發(fā)病率為8.8%~25.9%,在美洲為18.1%~27.8%,在東亞和中東地區(qū)分別為2.5%~7.8%、8.7%~33.1%;并且1995年以來GERD發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),尤其在東亞地區(qū)增長速度較快[5]。另有研究表明,目前在發(fā)達(dá)國家中每個(gè)星期出現(xiàn)至少一次GERD癥狀的人約占10%~20%,這也被認(rèn)為是降低工作效率和增加缺工次數(shù)的原因之一,被視為一大公共健康問題[8-9]。因此GERD發(fā)病率的增加和其對(duì)人類生活影響的越來越明顯,驅(qū)使著讓更多的研究揭示GERD發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。

    注:NC為正常對(duì)照組;CRS為慢性束縛應(yīng)激組

    目前眾多研究已證實(shí),心理應(yīng)激在GERD發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用[3,10-11]。根據(jù)內(nèi)鏡下有無食管黏膜損傷,可將GERD分為3種類型:非糜爛性反流病(non-erosive reflux disease,NERD)、糜爛性食管炎(erosive esophagitis,EE)、Barrett食管(Barrett′s esophagus,BE)[12-13]。通過內(nèi)鏡與組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),將近60%的GERD患者食管黏膜未見明顯病變[14],屬于NERD患者。然而在研究心理應(yīng)激在GERD發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究中作用時(shí),往往因不易獲取倫理批準(zhǔn)或患者知情同意、無法及時(shí)全面觀察機(jī)體病理生理變化及各層組織形態(tài)學(xué)變化等因素而難以實(shí)現(xiàn),而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷某晒⒔鉀Q了上述問題。

    相比于其他心理應(yīng)激動(dòng)物模型,如避水應(yīng)激、擁擠應(yīng)激及母嬰分離應(yīng)激,束縛應(yīng)激作為一種非損傷性刺激,能夠較好地模擬人類生活中“無法控制”的心理狀態(tài),既與人類產(chǎn)生應(yīng)激及其導(dǎo)致的心身性疾病過程相似。因此,目前束縛應(yīng)激模型被廣泛研究者所使用并取得了理想的成果。本實(shí)驗(yàn)我們采用小鼠慢性束縛應(yīng)激模型,初步探討心理應(yīng)激與GERD的相關(guān)性。

    根據(jù)國外研究者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,小鼠慢性束縛應(yīng)激模型的成功建立通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重、飲食量、HPA軸相關(guān)激素水平及其他重要內(nèi)分泌器官(胰腺)功能的變化來決定[15]。體重作為反應(yīng)小鼠精神及身體總體狀況最基本的指標(biāo),束縛應(yīng)激對(duì)其有明顯的影響。與此同時(shí),以往的研究普遍認(rèn)為下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)在機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)中起著核心作用,而其作用又通過與其它各系統(tǒng)之間的交互作用得以實(shí)現(xiàn)[16]。應(yīng)激狀態(tài)下,體質(zhì)量明顯降低,抑制體質(zhì)量增長原因較多,其中皮質(zhì)醇升高是其重要因素[17]。也有研究顯示,小鼠在慢性精神應(yīng)激后食欲、體溫、內(nèi)分泌代謝功能都會(huì)出現(xiàn)紊亂[18]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雖然2組小鼠平均每日飲食量無顯著差異,但CRS組小鼠HPA軸相關(guān)激素水平較NC組小鼠高且2組體重增加量具有顯著差異。這一結(jié)果說明了CRS組小鼠受到應(yīng)激后HPA軸被激活,產(chǎn)生了一系列全身性變化,導(dǎo)致小鼠基本指標(biāo)的改變。

    GERD的表現(xiàn)則集中在食管黏膜炎癥反應(yīng)及病理表現(xiàn)上,評(píng)判的標(biāo)準(zhǔn)也多源于GERD相關(guān)研究,包括對(duì)組織的評(píng)估如:潰瘍、糜爛、充血、水腫、基底細(xì)胞厚度、固有層乳頭長度、上皮內(nèi)中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞/嗜酸性粒細(xì)胞浸潤[19]。本研究結(jié)果顯示,CRS組小鼠在慢性應(yīng)激后可出現(xiàn)食管及胃組織上皮細(xì)胞增厚、黏膜層各類炎性細(xì)胞的浸潤等變化,而NC組小鼠食管、胃組織未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

    綜上所述,束縛應(yīng)激作為一種非損傷性刺激的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,能夠較好地模擬人類生活中心理應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)。雖然目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)用以評(píng)價(jià)慢性束縛應(yīng)激模型的建立是否成功,但我們可以通過不同角度觀察機(jī)體病理生理變化,分析其原因能夠確認(rèn)模型成功與否。除此之外,束縛應(yīng)激對(duì)各大系統(tǒng)的影響已日漸明了,但其在胃食管消化系統(tǒng)尤其GERD疾病方面的作用機(jī)制還有待深入的研究。本研究的目的在于一方面為后期深入研究精神心理因素在GERD發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制提供簡單有效并且具有借鑒意義的實(shí)驗(yàn)方法;另一方面為束縛應(yīng)激模型的成功建立提供參考指標(biāo),并為研究提供新的思路。

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