腸道微生態(tài)影響絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的研究進展①

李麗娟 林 靜 王 凌

(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院暨婦產(chǎn)科研究所，復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點實驗室,上海200011)

腸道微生物自人出生后即被獲得，成年人腸道中存在大約1014個細菌，其數(shù)量是人體細胞的10倍之多[1]。腸道微生物的基因超過5 × 106個，比人類基因數(shù)多150倍[2]，常與人類基因組共同起作用，被稱為人體的“第二基因組”[3]。它還被認為是一種多細胞器官，以多種方式參與宿主相互作用并影響宿主[3]。研究表明，腸道微生物對宿主生物實現(xiàn)某些方面的生理功能來說是必不可少的，它可以促進難以消化的多糖代謝并產(chǎn)生必需的維生素，促進宿主的腸上皮和免疫系統(tǒng)發(fā)育分化，保護機體免受機會性病原體的侵襲，并且在維持組織穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[4]。最近研究還表明[5]，人體內(nèi)微生物群影響宿主其他組織的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)，包括骨組織。這為我們研究和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供了新思路。

在生理條件下，機體通過破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成間的平衡來維持骨骼穩(wěn)態(tài)[6]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis,PMO)是指絕經(jīng)后婦女由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，出現(xiàn)以骨量降低和骨組織的顯微結(jié)構(gòu)退行性變?yōu)樘卣?，骨脆性和骨折易感性增加的一種全身代謝疾病[7]。在絕經(jīng)后婦女中，骨質(zhì)疏松引起的骨折比腦卒中、心肌梗塞等更為常見[8]。由骨質(zhì)疏松引起的骨折具有破壞性后果，特別是在老年人中。 椎骨骨折是嚴重疼痛和跛足的根源，而髖部骨折僅在第一年就導(dǎo)致24%～30%的死亡率[9]。 此外，幾乎50%的幸存者遭受永久性殘疾[10]。據(jù)報道，超過50%的絕經(jīng)后婦女患有骨質(zhì)疏松性骨折，預(yù)計隨著預(yù)期壽命的增長而增加。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥因為它的高發(fā)病率和骨質(zhì)疏松性骨折的嚴重后果，對家庭或社會造成了嚴重的負擔(dān)，因此，我們需要采取積極的預(yù)防和治療措施來應(yīng)對該疾病[11]。

研究表明PMO中的骨質(zhì)流失與宿主免疫反應(yīng)密切相關(guān)，而宿主免疫反應(yīng)又受到腸道微生物群的調(diào)控[12,13]。益生菌能夠防止骨流失，從而在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮積極地治療作用[14,15]。腸道微生物對骨代謝的影響為PMO的管理提供了一個新的方式[16]。

1 女性雌激素衰退是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要誘因

Fuller Albright早在1940年發(fā)表了他對絕經(jīng)期雌激素缺乏和骨質(zhì)疏松癥之間因果關(guān)系的觀察結(jié)果，他介紹了更年期激素治療(Menopausal hormone therapy，MHT)預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的概念[17-21]。雌激素缺乏導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)化(吸收和形成)的速率增加，而骨吸收和骨形成的速率并不平衡，其中骨吸收更加占優(yōu)勢[22]。更年期的初始階段，雌激素水平下降刺激較大程度的骨吸收和較小程度的骨形成，小程度的骨形成又造成一段時間內(nèi)快速的骨損失。 初始階段之后是一個更緩慢但更漫長的骨質(zhì)流失期，這個時期主要影響到骨骼的皮質(zhì)部分[12]。目前研究表明[23]，在一定的窗口期內(nèi)，激素補充治療的益處要大于它給機體健康帶來的風(fēng)險。

雌激素可以通過激活雌激素受體α、Wnt/β-Catenin 信號通路[24]或Notch 信號通路[25]來改善人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的能力，進而起到調(diào)節(jié)骨代謝、保護骨組織的功能。Li 等[6]發(fā)現(xiàn)與沒有骨質(zhì)疏松癥的患者相比，患有PMO的婦女TNF-α水平升高。 TNF-α和PMO患者體內(nèi)的RANK(Recep-tor activator for nuclear factor-κB)水平呈高度正相關(guān)關(guān)系。在體外，TNF-α通過激活NF-κB(Nuclear factor-κB)信號通路和PI3K/Akt信號通路來促進破骨細胞分化因子(Receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)誘導(dǎo)的破骨細胞分化生成。 此外，PI3K/Akt的抑制完全阻斷了TNF-α對NF-κB信號通路的活化和促破骨細胞生成的協(xié)同作用，表明TNF-α通過激活PI3K/Akt信號通路協(xié)同促進RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化生成，最終在PMO發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

在小鼠中，卵巢切除(Ovariectomy，OVX)通過促進初始CD4+細胞分化為成熟Th17細胞來增加Th17細胞的數(shù)量，這是細胞因子如TGF-β、IL-6、IL-1β和TNF驅(qū)動的結(jié)果，這些因子都是由于雌激素缺乏而誘導(dǎo)產(chǎn)生的[26]。Th17細胞是CD4+細胞中的一類能促進破骨細胞分化的亞群[12，27]，通過分泌IL-17A、IL-1、IL-6、RANKL、TNF以及低水平的IFN-γ有效地誘導(dǎo)破骨細胞的生成。 IL-17A刺激成骨細胞釋放RANKL，并通過上調(diào)RANK從而促進破骨細胞的分化。在PMO患者中可以觀察到IL-17的血清水平升高。此外，雌激素可以直接抑制CD4+T細胞向Th17細胞的分化。沉默IL-17R 或抗IL-17抗體能夠預(yù)防OVX誘發(fā)的骨質(zhì)流失，這一結(jié)果突出了IL-17在骨質(zhì)流失中的重要性。總之，性激素缺乏能夠促進Th17細胞的分化成熟，聯(lián)合升高的TNF-α、RANKL、IL-17等細胞因子，導(dǎo)致PMO的發(fā)生[28]。

雌激素缺乏是絕經(jīng)后女性發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的主要風(fēng)險因素，50歲以上的女性中有一半在其一生中會經(jīng)歷與骨質(zhì)疏松相關(guān)的骨折。以往雌激素補充療法一直是本病的主要治療方法，它可以縮短破骨細胞(Osteoclast,OC) 壽命，減少絕經(jīng)后婦女體內(nèi) OC 生成，增加 OC 凋亡，抑制骨重吸收[29]，由于雌激素補充療法有一些令人無法接受的副作用(如增加子宮內(nèi)膜癌的患病風(fēng)險)，所以新型療法仍被需要來對抗絕經(jīng)后骨質(zhì)流失。

2 腸道微生物在性激素缺乏引起骨質(zhì)流失的發(fā)生中處于中心地位

數(shù)以萬億計的微生物棲息在腸道內(nèi)，與宿主形成互利關(guān)系[30]。 這些共生微生物被稱為微生物群，整體上可以看作是一種多細胞器官，以多種不同方式與宿主進行物質(zhì)交換和信息交流[16,31]。甚至有人提出腸道微生物群是我們的“第二基因組”，動態(tài)整合宿主及其環(huán)境的信號，影響機體健康和患病風(fēng)險[3]。

腸道微生物群在調(diào)節(jié)骨骼健康方面發(fā)揮重要作用[32]，腸道微生物群在性激素缺乏引起的骨質(zhì)流失的過程中處于中心地位[25]。在無菌(Germ-free,GF)小鼠中，即使在性激素缺乏的情況下，破骨細胞生成因子[如巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、TNF、IL-1]的產(chǎn)生也不會增加，即不能刺激骨吸收或引起骨質(zhì)流失。此外，用益生菌鼠李糖乳桿菌GG(LGG)或市售益生菌增補劑VSL#3(益生菌制劑的商品名，含有8種益生菌)每周兩次治療性激素缺陷小鼠能降低其腸道通透性，減輕腸道和骨髓炎癥，完全防止骨質(zhì)流失的發(fā)生；相反，補充大腸桿菌的非益生菌菌株或突變體LGG并不具有保護性。上述實驗表明[28]，腸道微生物群和腸道通透性增加在觸發(fā)炎癥途徑中發(fā)揮重要作用，這對于在性激素缺陷小鼠中誘導(dǎo)骨質(zhì)流失的作用至關(guān)重要。降低腸道通透性的益生菌有潛力成為PMO的治療策略。

在GF小鼠中，性激素缺乏不會促使產(chǎn)生TNF的T細胞增生，也不會增加骨髓和腸中TNF的產(chǎn)生。此外,在微生物群缺乏的情況下,性激素缺乏時骨髓和腸組織中的IL-17 水平亦沒有增加。綜上所述，腸道微生物群的調(diào)節(jié)是性激素缺乏誘導(dǎo)骨質(zhì)流失所必需的中間環(huán)節(jié)。另一些研究表明[33]，通過抗生素治療改變腸道微生物組成的多樣性和數(shù)目可以調(diào)節(jié)性激素缺乏雌性小鼠的骨質(zhì)流失量。總之，腸道菌群與性激素缺乏引起的骨質(zhì)流失密切相關(guān)。

3 腸道微生物調(diào)控骨代謝的機制

腸道微生物可以通過影響宿主的代謝和免疫反應(yīng)，來調(diào)節(jié)機體的骨代謝，從而在PMO的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

3.1 腸道微生物通過宿主的免疫系統(tǒng)調(diào)控骨代謝 與腸道相關(guān)的炎癥和自身免疫病癥與骨量降低有關(guān)，提示腸道與骨代謝之間存在關(guān)聯(lián)[34]。 腸道微生物被證明可以調(diào)節(jié)腸道和全身免疫反應(yīng)[12]，并且已經(jīng)確定免疫系統(tǒng)與骨代謝之間存在關(guān)聯(lián)，表明腸道微生物可能通過改變機體的免疫反應(yīng)影響骨代謝[13]。

小鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育的最重要觸發(fā)因素是出生后立即暴露于微生物組分。Hansen等[35]的研究表明,出生后短期 Germ-free的存在永久改變了Treg、NK 和 NKT 細胞的水平以及細胞因子的產(chǎn)生，即腸道微生物的延遲定殖導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的永久性變化。總之存在時間窗口,能夠通過腸道微生物的人工定植修改宿主未來的免疫表型。此外，腸道微生物的延遲定殖導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的永久性變化。鑒于骨代謝與宿主免疫間的密切聯(lián)系，以上研究提示，腸道微生物可能通過對宿主固有免疫的調(diào)控，間接影響骨代謝。

腸道微生物對CD4+T細胞亞群的出現(xiàn)和維持有強烈的影響。 比如分段絲狀桿菌(SFB)能誘導(dǎo)Th17細胞的分化[36]、脆弱擬桿菌誘導(dǎo)Th1細胞和Treg的分化[37]，表明腸道的微生物和宿主細胞之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。

Sj?gren等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)培養(yǎng)的(Conven-tionally raised，CONV-R)小鼠相比，無菌(Cerm-free，GF)小鼠表現(xiàn)出更多的骨量，這與骨中破骨細胞數(shù)量的減少，從而使骨吸收減少相關(guān)。將CONV-R小鼠腸道微生物群移植于GF小鼠腸道內(nèi)可其使骨量正?；?。此外，GF小鼠的骨髓中CD4+T細胞和破骨細胞前體細胞的數(shù)量降低，同樣，這種差異可以通過移植正常腸道菌群來消除。與CONV-R小鼠相比，GF小鼠的骨中表現(xiàn)出炎性細胞因子表達的降低?？傊c道微生物群能調(diào)節(jié)小鼠的骨量，并且可能是通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來減少破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收。

Atarashi等[38]研究發(fā)現(xiàn)，腸內(nèi)微生物亞群如SFB、檸檬酸桿菌、大腸桿菌O157和某些細胞外病原體的定殖并黏附到腸上皮細胞(Epithelial cells，ECs)時，腸Th17細胞被誘導(dǎo)并聚集。 也就是說，微生物黏附到ECs是 Th17細胞被誘導(dǎo)的關(guān)鍵線索。而前面我們已經(jīng)知道IL-17 是引起骨量丟失的重要炎癥因子,所以可以進一步推斷腸道微生物確實是通過影響宿主的免疫系統(tǒng)來調(diào)控骨代謝的。

3.2 腸道益生菌可以通過抑制炎癥反應(yīng)來防止骨質(zhì)流失 益生菌被定義為在給予足量時能帶來健康益處的活微生物。益生菌除了能調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答[39]，還可以改變腸道微生物群的組成和代謝活性[40]，并且能增強上皮屏障功能，后者可能是最重要的機制[41]。

在細胞水平上，性激素缺乏引起骨丟失的重要機制是破骨細胞形成和破骨細胞壽命的增加[42，43]。 增加破骨細胞生成的主要驅(qū)動因素是免疫因子RANKL和TNF的產(chǎn)生增多[44]。 因此，依賴于性激素缺失的骨丟失被認為是一種炎性骨丟失。

Ohlsson等[45]的研究中選擇了單純 L-副干酪乳桿菌DSM13434(L-para)和L-副干酪乳桿菌DSM13434、植物乳桿菌DSM15312、DSM15313乳桿菌構(gòu)成的乳桿菌混合物(L-mix),并且在OVX手術(shù)前的2周就開始分別用這兩種組合的益生菌來喂養(yǎng)小鼠。 L.para和L.mix處理都能保護小鼠免受OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失。益生菌治療減少了兩種炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的表達，并增加了OVX小鼠骨中骨保護素(Osteoprotegerin,OPG)。OPG是RANKL的誘導(dǎo)受體[46]，通過與RANKL的結(jié)合減少破骨細胞的產(chǎn)生，是破骨細胞生成的有效抑制劑。

Britton等[32]也已經(jīng)報道了益生菌的骨保護作用，他們測試了羅伊氏乳桿菌對OVX誘導(dǎo)的骨丟失的作用。結(jié)果顯示羅伊氏乳桿菌治療改變了腸道微生物的組成，在體外抑制破骨細胞的生成，防止了卵巢衰竭誘導(dǎo)的骨吸收。此外，益生菌的治療抑制了OVX誘導(dǎo)的骨髓CD4+T細胞的增加，支持了腸道微生物通過調(diào)節(jié)骨中的免疫狀態(tài)從而影響破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收的觀點。

Parvaneh等[17]的一項研究中，也證明了益生菌長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)能從OVX誘導(dǎo)的骨丟失中保護大鼠。

生物多樣性下降被認為是疾病狀態(tài)的一個指標，反映出生存環(huán)境惡化和資源枯竭[47]。雌激素的缺失導(dǎo)致微生物群落多樣性降低，而隨著益生菌的使用，腸道中的微生物多樣性將增加[48]。腸道微生物群與腸壁之間相互作用的失調(diào)在性激素缺陷小鼠中誘導(dǎo)炎癥和骨質(zhì)流失中起關(guān)鍵作用。

3.3 腸壁通透性和骨質(zhì)流失 腸上皮是宿主和腸腔微生物群之間的界面。腸通過細胞間隙的大小控制腸腔和黏膜下層之間的分子運輸，這個選擇性生理屏障能夠阻擋較大直徑分子通過。腸壁與腸腔微生物密切接觸，不斷識別腸腔內(nèi)的外來抗原并對之做出反應(yīng)[49]。增加的通透性允許更大的分子和潛在的抗原進入上皮黏膜下層，這可能引發(fā)異常的腸道和機體炎癥反應(yīng)[50]。因此，維持腸腔和黏膜下層之間緊密的機械屏障對健康至關(guān)重要。另外破骨細胞生成細胞因子是由駐留在腸上皮下組織中的免疫細胞產(chǎn)生，任何腸通透性改變都可能提高破骨細胞生成細胞因子水平從而影響骨密度。

性激素對維持腸腔內(nèi)常駐菌群和腸壁黏膜下層之間生理屏障的緊密性起重要作用[51],所以性激素水平的降低將增加腸道通透性。因此,任何可以改善腸道通透性的治療方法都將有利于預(yù)防性激素缺失導(dǎo)致的骨質(zhì)流失。益生菌即是通過降低腸道通透性的途徑來降低炎癥反應(yīng)從而起到保護骨的作用。

3.4 腸道微生物通過影響機體的代謝來調(diào)節(jié)骨代謝

3.4.1 腸道微生物群誘導(dǎo)IGF-1并促進骨形成和生長 Yan等[52]研究發(fā)現(xiàn)，盡管將常規(guī)的無特定病原體( Specific-pathogen-free,SPF) 的腸道微生物群移植于GF小鼠腸道內(nèi)會導(dǎo)致宿主骨量急劇降低,但在微生物長期穩(wěn)定定植的小鼠腸道內(nèi)移植SPF,宿主中骨形成和骨量增加將占主導(dǎo)地位,導(dǎo)致骨骼縱向和橫向的雙發(fā)展。經(jīng)檢測,后者小鼠血清中胰島素樣生長因子1(Insulin-like growth factors,IGF-1)顯著上升。IGF-1是一種對骨骼生長有明確正向調(diào)節(jié)作用的激素,同時可正向反映腸道微生物的定植狀況。后者小鼠的肝臟和脂肪組織中IGF-1產(chǎn)量亦顯著增加。相反，給常規(guī)小鼠以抗生素治療會降低血清IGF-1并抑制骨形成。

盡管目前尚未見“腸道微生物-IGF-1-骨代謝”調(diào)控軸的報道，鑒于IGF-1在骨代謝過程中的重要作用，有理由推斷腸道微生物可能通過調(diào)控與骨代謝密切相關(guān)的IGF-1水平，參與調(diào)控機體骨代謝平衡[53]。

另有研究表明，與GF小鼠相比， SPF小鼠的新生兒生長更快，其IGF-1水平更高。 此外，他們發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)不足的情況下，用特定的細菌菌株如乳酸桿菌使腸道菌群單一化足以改變“生長激素-IGF-1軸”并對小鼠的骨生長產(chǎn)生積極影響[54]。

3.4.2 短鏈脂肪酸通過影響IGF-1 的水平來間接影響骨代謝 同樣在Yan等[52]的研究中，用短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids， SCFAs)補充給抗生素處理過的小鼠，會促使IGF-1水平和骨量恢復(fù)至與未經(jīng)抗生素處理的小鼠相同的水平。SCFAs包括乙酸、丙酸、丁鹽酸等,可通過腸上皮細胞進入機體血液循環(huán),影響宿主的免疫反應(yīng),抑制組蛋白脫乙酰酶的作用從而促進抗炎型細胞的作用，以維持免疫穩(wěn)態(tài)。因此，SCFAs的產(chǎn)生可能是微生物群增加血清IGF-1的一種機制。腸道微生物群對骨骼提供合成代謝的刺激可能由IGF-1介導(dǎo)。大多數(shù)數(shù)據(jù)表明微生物群體誘導(dǎo)宿主IGF-1合成以影響其生長。

SCFAs能夠誘導(dǎo)IGF-1的產(chǎn)生，它是益生元發(fā)酵的主要產(chǎn)物，賦予人體健康諸多益處，如免疫調(diào)節(jié)，SCFAs能夠?qū)⒅嗵谴碳魏思毎a(chǎn)生的細胞因子調(diào)節(jié)為抗炎細胞因子。

3.5 腸道微生物可以通過影響機體的營養(yǎng)狀況來影響骨代謝 影響腸道黏膜的營養(yǎng)攝取可能是微生物對骨重建發(fā)揮作用的重要機制。腸道微生物群在食物消化吸收、能量供應(yīng)和調(diào)節(jié)維生素的生成和吸收方面起關(guān)鍵作用。 對GF和CONV-R進行比較的研究表明，微生物群可促進腸道單糖的吸收，并誘導(dǎo)宿主對能量的攝取和儲存[55]。此外，腸道微生物群合成維生素B和K族維生素[56]，因此有助于確保人體有足夠的維生素攝入量，特別是在食物攝入不足或不良飲食習(xí)慣所造成的營養(yǎng)不良的情況下。 腸道微生物群也調(diào)節(jié)鈣的吸收，這可能是通過改變腔內(nèi)pH值和增加鈣溶解度來實現(xiàn)的[57]。 因此，腸道微生物通過對營養(yǎng)攝取和能量捕獲的作用可以促進宿主骨骼健康。

在營養(yǎng)不良的情況下，移植乳酸桿菌菌株將會促進果蠅幼蟲生長，這是在最近的一項研究中發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)不良時微生物群對生長軸的影響[58]。將腸道中只有植物乳桿菌(Lp)WJL菌株或NIZO2877菌株存在的幼年小鼠和GF幼年小鼠以斷奶或缺乏營養(yǎng)的飲食飼養(yǎng)， Lp WJL或Lp NIZO2877幼體的體重和身長比GF幼體有更顯著的增長；并且Lp WJL組比Lp NIZO2877組具有更顯著的增長，相應(yīng)的體重、身長和股骨長度增加有2倍之差。有趣的是，兩種菌株之間的定量差異并不是由于食物和卡路里攝入量的差異造成的。因此，植物乳桿菌的生長促進作用似乎是菌株特異性的，這會進一步使我們理解益生菌對微生物群和骨的影響。

4 總結(jié)與展望

腸道微生物在骨代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，它在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展中處于中心地位，這為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療提供了新的思路。腸道微生物可以通過影響宿主的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)、影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及通過益生菌的保護作用來實現(xiàn)對骨代謝的調(diào)節(jié)。目前對腸道微生物影響骨代謝的研究還不是很透徹，很多都是基于表型的研究，分子機制尚待進一步的揭示。我們有理由相信在未來腸道微生物將會在包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥等多種疾病的治療中成為新的重要靶點。