系統(tǒng)性硬化癥患者外周血中miR-155的表達與Th17細胞的關(guān)系

周 燕 張媛媛

(重慶市第四人民醫(yī)院檢驗科，重慶400014)

系統(tǒng)性硬化癥(Systemic sclerosis)是一種慢性自身免疫疾病，目前臨床主要以控制患者癥狀、延緩對靶器官的損傷等治療為主，以往研究主要從遺傳與環(huán)境因素、免疫學異常、血管病變等方面探索其具體的發(fā)病機制[1]。Th17細胞是T效應(yīng)淋巴細胞亞群的T輔助細胞之一，其分泌的細胞因子可在自身免疫及纖維化疾病中發(fā)揮重要作用[2]。miR-155是一種多功能性miRNA，可通過下調(diào)靶基因CTLA-4表達進而參與造血、免疫等多種病理生理過程，同時可在多種惡性腫瘤、類風濕等疾病中發(fā)揮重要作用[3]。miR-155在系統(tǒng)性硬化癥中尚未見研究報道，因此本研究探討了系統(tǒng)性硬化癥患者外周血中miR-155表達及其與Th17細胞的關(guān)系，旨在為臨床治療提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 選取2015年6月至2017年3月于我院風濕免疫科住院及門診治療的系統(tǒng)性硬化癥患者58例為研究組，另選取本院同期健康體檢者61例作為對照組。研究組中男10例，女48例，年齡21～60歲，平均(40.35±6.78)歲，病程為2～24月，平均(13.12±10.02)個月。對照組中男11例，女50例，年齡21～61歲，平均(41.28±9.47)歲。兩組臨床資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。納入標準:①系統(tǒng)性硬化癥患者符合相關(guān)診斷標準[4]；②病程≤2年；③臨床資料完整；④未經(jīng)治療或治療后停藥3個月以上者；⑤患者知情且簽署同意書。排除標準:①皮膚嚴重萎縮、硬化且處于晚期患者；②合并心、肺、腎等嚴重疾??；③妊娠或哺乳期患者；④精神病患者；⑤合并有心腦血管、肝腎等原發(fā)性疾??；⑥假性硬皮病或外傷引起者。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)，qRT-PCR試劑盒(美國Invitmgen公司)，ELISA試劑盒(中國深圳晶美生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 兩組受試人員于次日清晨抽取空腹靜脈血10 ml，肝素鈉抗凝，其中一部分分離外周血單核細胞用于檢測miR-155表達水平，另一部分用于檢測血漿IL-17、IL-21水平、Th17細胞及胞內(nèi)CTLA-4的表達水平。

1.2.2 qRT-PCR法檢測兩組外周血單核細胞中miR-155表達水平 在1.5 ml離心管中加入1 ml紅細胞裂解液并取抗凝血0.5 ml混勻，置于室溫10 min，5 000 r/min離心5 min后收集底部的細胞，并重復一遍，按照Trizol試劑盒操作步驟提取總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進行qRT-PCR反應(yīng)、檢測miR-155的相對表達量，反應(yīng)體系為20 μl:10 μl 2×SYBR Mix，10×cDNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，H2O 8 μl，反應(yīng)程序設(shè)定為95℃ 5 min(預變性)，95℃ 30 s(變性)、60℃ 30 s(退火)，72℃ 1 min(延伸)，共30個循環(huán)，72℃ 10 min(終延伸)。每個樣本設(shè)置3個平行反應(yīng)復孔。在PCR儀上進行反應(yīng)，其中引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。反應(yīng)結(jié)束后對數(shù)據(jù)進行分析，miR-155以U6作為內(nèi)參按照2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.3 檢測血漿IL-17、IL-21水平 將兩組人員靜脈血靜置并留取血漿0.5 ml，-20℃冰箱保存，嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明進行操作，將其置于酶標儀上進行檢測并讀取A值，運用ELISA軟件繪制標準曲線并計算血清IL-17、IL-21的濃度。

1.2.4 流式細胞儀檢測外周血Th17細胞及CTLA-4表達比例 收集留存血漿后剩余的血細胞并加入磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，分離單個核細胞，濃度調(diào)整為1×106細胞/ml，將其滴入24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1.5×106細胞/ml，分別在37℃恒溫、5%CO2條件下培養(yǎng)5 h。采用2支試管收集細胞，1 000 r/min離心5 min后棄上清液并加入100 μl PBS重懸細胞，每管分別加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗人CD4單抗，室溫下孵育30 min。用PBS洗滌細胞，1 000 r/min 離心5 min后棄上清，加入500 μl固定液混合均勻并放置30 min，離心后棄上清并加入500 μl破膜劑混合均勻，重復一次。將別藻藍蛋白(APC)標記的抗人IL-17單抗2 μl加入其中一支試管，在另一支試管中加入CTLA-4 APC 2 μl，4℃下孵育30 min。孵育后再次清洗并離心10 min，棄上清并加入500 μl PBS重懸，立即上機檢測。設(shè)標記抗體為同型對照并以CD4+設(shè)門，采用美國BD公司FAcsCalibur流式細胞儀檢測CD4+、CTLA-4+、IL-17+陽性細胞及其所占比例，其中IL-17+細胞代表Th17細胞。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血miR-155、IL-17、IL-21水平的比較 研究組患者外周血miR-155、IL-17、IL-21水平均明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

2.2 兩組外周血Th17/CD4+、CTLA-4/CD4+與Th17細胞的比較 研究組外周血Th17細胞及其占CD4+T細胞比例明顯高于對照組，CTLA-4的表達比例明顯低于對照組(P<0.05)。見表3。

2.3 檢測系統(tǒng)性硬化癥患者miR-155、CTLA-4、Th17細胞、IL-17及IL-21相關(guān)性 Pearson法顯示外周血miR-155表達水平與Th17細胞、IL-17及IL-21呈正相關(guān)，CTLA-4表達與Th17細胞、IL-17及IL-21呈負相關(guān)，Th17細胞與IL-17、IL-21呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

2.4 ROC分析研究組患者外周血miR-155表達與Th17細胞的診斷價值 ROC分析顯示miR-155的敏感度為79.73%，特異度為97.62%，截斷值為1.16；Th17細胞的敏感度為72.97%，特異度為92.86%，截斷值為1.16%。見表5、圖1。

2.5 影響系統(tǒng)性硬化癥患者的相關(guān)因素分析 將影響系統(tǒng)性硬化癥患者相關(guān)因素進行Logistic多元回歸分析，結(jié)果顯示患者外周血miR-155表達水平、Th17細胞比例、CTLA-4表達水平、IL-17及IL-21均是影響系統(tǒng)性硬化癥患者的危險因素。見表6。

GroupnmiR-155IL-17(pg/ml)IL-21(pg/ml)Control group610.98±0.1217.29±5.1211.26±1.75Research group582.03±0.2156.27±6.2928.78±3.52t33.69637.15834.637P0.0000.0000.000

GroupnTh17/CD4+Th17 cellCTLA-4/CD4+Control group610.23±0.120.52±0.341.44±0.21Research group581.75±0.681)4.87±1.161)0.47±0.071)

Note：1)P<0.05 compared with the control group.

表4 相關(guān)性檢測結(jié)果(r/P)

Tab.4 Correlation test results(r/P)

IndexmiR-155CTLA-4Th17IL-17CTLA-4-0.335/0.01---Th170.450/0.000-0.501/0.000--IL-170.417/0.001-0.458/0.0000.698/0.000-IL-210.328/0.012-0.275/0.0370.444/0.0000.271/0.040

表5 研究組患者miR-155與Th17細胞的ROC分析

Tab.5 ROC analysis of miR-155 and Th17 cells in study group

DetectionindicatorAUCStandarderrorZ statistics95%CIPmiR-1550.8580.0379.5850.781-0.916<0.000Th17 cell0.8310.0408.3990.751-0.895<0.000

圖1 系統(tǒng)性硬化癥患者miR-155與Th17細胞的ROC分析Fig.1 ROC analysis of miR-155 and Th17 cells in patients with systemic sclerosis

表6 影響系統(tǒng)性硬化癥患者的相關(guān)因素分析

Tab.6 Analysis of related factors affecting patients with systemic sclerosis

Influencing factorβSEWald χ2POR95%CImiR-1550.8160.3744.7600.0122.2611.528-3.347Th171.0680.4276.2510.0032.9082.021-4.185IL-170.5240.3082.8980.0221.6891.305-2.187IL-210.6140.3543.0110.0261.8481.347-2.536CTLA-40.8000.4133.7500.0112.2251.643-3.013

3 討論

系統(tǒng)性硬化癥可影響機體內(nèi)多個內(nèi)臟系統(tǒng)的結(jié)締組織發(fā)生疾病，嚴重降低患者生活質(zhì)量，明確其發(fā)病機制并針對性治療可有效降低患者疾病嚴重程度[5]。研究表明系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)生常與下游多個免疫細胞的異常相關(guān)，IL-6、TNF-α在系統(tǒng)性硬化癥的不同階段時其表達水平存在明顯區(qū)別并參與疾病發(fā)生發(fā)展過程[6,7]。miRNAs可在細胞增殖、分化等過程中發(fā)揮重要作用，同時可通過調(diào)控靶基因表達對機體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞等其他免疫細胞產(chǎn)生重要影響[8]。

miR-155是由BIC(B細胞非編碼集合基因簇)基因編碼，研究表明miR-155可在銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種免疫相關(guān)性疾病中異常表達，可通過調(diào)節(jié)靶基因CTLA-4的表達參與機體免疫反應(yīng)過程[9,10]?；罨腂細胞、T細胞可促進miR-155表達，CTLA-4是T細胞活化的重要負性調(diào)節(jié)因子，而miR-155可通過降低靶基因CTLA-4水平進而促使T細胞活化[11]。本研究結(jié)果顯示研究組患者外周血miR-155、IL-17、IL-21水平均顯著高于對照組，說明系統(tǒng)性硬化癥患者中miR-155呈高表達。其中IL-17、IL-21可通過增強TNF對成纖維細胞與角質(zhì)形成細胞的活性進而增加纖維細胞促炎因子數(shù)量[12]。推測miR-155表達異?？赡艽偈辜毎蜃影l(fā)生紊亂并造成系統(tǒng)性硬化癥患者免疫異常。本研究發(fā)現(xiàn)外周血中miR-155相對表達量超過1.42時可能已發(fā)生系統(tǒng)性硬化癥，推測miR-155可作為臨床診斷系統(tǒng)性硬化癥的分子標志物。

CD4+T細胞可根據(jù)細胞的功能分為Th1、Th2、Th17、Treg四個亞群，病理狀態(tài)下促/抗炎因子分泌異常導致Th1與Th2失衡引起機體免疫功能異常，而Th17細胞可分泌IL-17、IL-21等在人類免疫相關(guān)性疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[13]。本研究結(jié)果顯示研究組外周血Th17細胞及其占CD4+T細胞比例顯著高于對照組，IL-17、IL-21水平均顯著升高，說明系統(tǒng)性硬化癥患者體內(nèi)Th17細胞過度表達并參與疾病的發(fā)生過程，且Th17細胞分泌IL-17、IL-21的能力高于正常人，ROC分析結(jié)果顯示Th17細胞大于3.11%時極可能發(fā)生系統(tǒng)性硬化癥。本研究結(jié)果顯示Th17細胞顯著高于對照組，而CTLA-4表達比例顯著低于對照組，相關(guān)性分析顯示miR-155表達與Th17細胞呈顯著正相關(guān)，而CTLA-4與Th17細胞呈顯著負相關(guān)，說明miR-155在系統(tǒng)性硬化癥患者外周血CD4+T細胞中上調(diào)表達并可促進CD4+T細胞向Th17型細胞分化。同時Logistic多元回歸分析顯示患者外周血miR-155表達水平、Th17細胞、CTLA-4表達水平、IL-17及IL-21均是影響系統(tǒng)性硬化癥患者的危險因素。

綜上所述，系統(tǒng)性硬化癥外周血中miR-155表達水平顯著升高，Th17細胞比例增加，二者呈顯著正相關(guān)并參與疾病發(fā)生、發(fā)展，檢測系統(tǒng)性硬化癥患者外周血miR-155表達、Th17細胞比例有助于臨床診斷，以miR-155為靶點的治療方案將有助于提高臨床療效。關(guān)于miR-155對Th17細胞發(fā)揮功能的具體機制有待進一步研究。