鈣衛(wèi)蛋白作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)志物的研究①

陶 李 杜 明 王昱斌 李光迪

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)中心,蘭州730000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性、自身免疫性疾病，目前病因不明。臨床多表現(xiàn)為手、足小關(guān)節(jié)的對(duì)稱性、侵襲性炎癥。免疫細(xì)胞的激活、炎癥介質(zhì)的浸潤(rùn)在RA的發(fā)生發(fā)展中扮演至關(guān)重要的角色[1，2]。

鈣衛(wèi)蛋白是由S100A8和S100A9兩種鈣結(jié)合蛋白組成的異源二聚體。作為一種炎癥性蛋白質(zhì)，其血清水平會(huì)在組織出現(xiàn)損傷或炎癥時(shí)升高[3，4]。有研究指出鈣衛(wèi)蛋白在RA患者滑膜及滑液中高表達(dá)，提示其可能參與RA的致病過(guò)程[5，6]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)RA組患者與骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarth-ritis,OA)組患者以及正常對(duì)照組血清鈣衛(wèi)蛋白水平，從而分析血清鈣衛(wèi)蛋白對(duì)于RA的診斷價(jià)值以及其與RA臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料 選取2017年10月至2018年5月在蘭州大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院的并且診斷明確的60例RA患者和48例OA患者，RA診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2010版美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)院/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟制定的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。OA診斷將中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)在2007年制定的《骨關(guān)節(jié)炎診治指南》(2007年版)[8]作為骨性關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)?；颊吲懦腥?、貧血以及其他自身免疫性疾病。健康對(duì)照組(HC)選自蘭州大學(xué)第二醫(yī)院體檢中心無(wú)疾病記錄的健康體檢者，共35例。健康對(duì)照組與RA組、OA組患者性別、年齡構(gòu)成比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有受試者無(wú)高血壓、心臟病、糖尿病等慢性系統(tǒng)性疾病，并排除合并其它自身免疫系統(tǒng)性疾病，且心、肝、腎等重要臟器功能均正常。本次研究獲得蘭州大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床及實(shí)驗(yàn)室資料的收集 通過(guò)蘭州大學(xué)第二醫(yī)院患者數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)70例RA患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室相關(guān)資料進(jìn)行整理收集。包括:①患者一般情況：年齡、性別、疾病持續(xù)時(shí)間；②患者臨床信息:疼痛持續(xù)時(shí)間、晨僵持續(xù)時(shí)間、28腫脹關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)(Swollen joint counts，SJC)、28疼痛關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)(Tender joint counts，TJC)、患者全身視覺(jué)模擬評(píng)分(100-mm Visual analogue scale,100-mm VAS)；③患者實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo):C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、血沉(Erythrocyte sedimentation rate，ESR)、類風(fēng)濕因子(Rheumatoid factor IgM，RF-IgM)、抗CCP抗體(anti-CCP)。并計(jì)算28關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評(píng)分(Disease activity score uses 28 joint counts，DAS28)[8]。

1.2.2 鈣衛(wèi)蛋白定量檢測(cè) 收取RA組、OA組以及健康人群的血清樣本，-80℃保存直到使用時(shí)取出，避免反復(fù)凍融。采用人鈣衛(wèi)蛋白ELISA試劑盒(武漢華美)檢測(cè)血清鈣衛(wèi)蛋白水平。首先每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本100 μl，覆蓋板貼，37℃孵育2 h。每孔加生物素抗體工作液100 μl，覆蓋新板貼，37℃孵育1 h。洗滌，每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μl，覆蓋新板貼，37℃孵育1 h。洗滌，每孔加底物溶液90 μl，37℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μl，5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀(北京朗普)在450 nm 波長(zhǎng)依次測(cè)量各孔的光密度(OD值)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行處理，定量數(shù)據(jù)表示為[中位數(shù)(四分位數(shù)間距)，median(IQR)]。RA患者血清鈣衛(wèi)蛋白水平與其臨床疾病活動(dòng)度及實(shí)驗(yàn)室相關(guān)參數(shù)之間的相關(guān)性，采用Spearman進(jìn)行相關(guān)分析。使用chi-square tests分析兩組陽(yáng)性率的差別。使用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行單變量分析，以分析兩組之間的差異。使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析3組或更多組之間的差異，以DAS28為因變量進(jìn)行多元線性回歸分析。繪制受試者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲線評(píng)估鈣衛(wèi)蛋白對(duì)RA的診斷的價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 基本資料詳見(jiàn)表1。

2.2 血清鈣衛(wèi)蛋白診斷RA的敏感度和特異度 如圖1所示，RA組(Median,77.7 ng/ml)和OA組(Median,28.6 ng/ml)血清鈣衛(wèi)蛋白水平明顯高于健康對(duì)照組(Median,8.9 ng/ml)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。此外，RA組血清鈣衛(wèi)蛋白水平要明顯高于OA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 患者和健康對(duì)照組基本情況

Tab.1 General characteristics of patients and controls

Features[median(IQ range)]RA(n=60)OA(n=48)HC(n=35)Age(year)58.5(53.3-64.8)54.2(48.6-68.3)52.5(46.1-60.6)Male/female8/528/405/30Calprotectin(ng/ml)77.7(16.2-174.4)28.6(11.9-42.9)8.9(7.2-10.1)Disease duration(year)10.0(5.0-14.8)16.8(7.6-25.9)CRP(mg/L)17.9(6.8-25.8)ESR(mm/h)34.0(16.3-45.0)Anti-CCP(U/ml)53(18.3-143.5)RF-IgM(U/ml)205(109.8-313.8)DAS284.2(3.2-5.6)

使用ROC曲線分析(圖2)，計(jì)算得到的鈣衛(wèi)蛋白cut-off值為46.08 ng/ml,其對(duì)于診斷RA的敏感度為63.3%,特異度為90.4%。曲線下面積0.820,95%可信區(qū)間為0.752～0.888。這說(shuō)明鈣衛(wèi)蛋白對(duì)于RA達(dá)到中等以上診斷價(jià)值。在這個(gè)cut-off值下，RA患者中的鈣衛(wèi)蛋白陽(yáng)性率為(38/60,63.3%)顯著高于OA組(8/48,16.7%)和正常對(duì)照組(0/35,0%)(P<0.01，圖3)。鈣衛(wèi)蛋白在RA中的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為82.6%，陰性預(yù)測(cè)值為77.3%。因此說(shuō)明鈣衛(wèi)蛋白可以很好地對(duì)RA組與OA組和健康對(duì)照組進(jìn)行區(qū)分。

2.3 血清鈣衛(wèi)蛋白水平與RA臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的相關(guān)性 RA患者血清鈣衛(wèi)蛋白水平與其28SJC(rs=0.521,P<0.01,圖4A)，28 TJC(rs=0.665,P<0.01，圖4B)，DAS28(rs=0.624,P<0.01，圖4C)，RF-IgM(rs=0.381,P<0.05，圖4D)，ESR(rs=0.248，P<0.05,圖4F)相關(guān)；而與CRP(rs=0.151,P=0.124,圖4E)，抗-CCP抗體水平(rs=0.187,P=0.077,圖4G)，疾病持續(xù)時(shí)間(rs=0.065,P=0.310,圖4H)和年齡(rs=0.197,P=0.072,圖4I)無(wú)相關(guān)性。因此說(shuō)明血清鈣衛(wèi)蛋白表達(dá)水平可以反映RA患者的疾病活動(dòng)度。

圖1 鈣衛(wèi)蛋白在RA組和對(duì)照組中的表達(dá)情況Fig.1 Calprotectin expression in RA patients and controlsNote: The differences between RA patients and controls were determined by non-parametric Kruskal-Wallis test.Each dot represents an individual serum.Bars display median and dotted line represents cut-off values 46.08.*.P<0.01.

圖2 鈣衛(wèi)蛋白診斷RA的ROC曲線Fig.2 ROC curves of calprotectinNote: AUC 0.5-0.7.Poor diagnostic value;Auc 0.7-0.9.Moderate diagnostic value;Auc>0.9.High diagnostic value.Std.Error=0.035，Asymptotic sig=0.001.

圖3 RA組和對(duì)照組中鈣衛(wèi)蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率Fig.3 Positive rate of calprotectin expression in patients with RA and controlsNote: The differences between RA patients and controls were determined by Chi-square test,*.P<0.01.

圖4 患者血清鈣衛(wèi)蛋白與RA臨床個(gè)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相關(guān)性分析(n=60)Fig.4 Correlation analysis between serum calprotectin and RA clinical laboratory indicators(n=60)Note: Spearman′ s rank correlation coefficient was used to assess correlations;P-values were shown.

表2 DAS28為因變量的多元線性回歸分析

Tab.2 Multivariate linear regression analysis of DAS28 as dependent variable

ModelUnstandardized coefficientsaBStd.ErrorStandardizedcoefficients BetatSig.Constant2.4770.9392.6370.011ESR0.0140.0050.2682.5710.013CRP0.0160.0080.2072.0200.048Diease duration-0.0020.019-0.009-0.0920.927Age0.0010.0170.0030.0340.973Calprotectin0.0090.0010.5575.8210.000

Note：a.Dependent Variable，DAS28 score.

2.4 以DAS28為因變量進(jìn)行多元線性回歸分析 結(jié)果(表2)顯示在矯正CRP、ESR、年齡、疾病持續(xù)時(shí)間后，鈣衛(wèi)蛋白與DAS28評(píng)分相關(guān)性(P<0.01)依然存在。并且結(jié)果還提示鈣衛(wèi)蛋白對(duì)于DAS28評(píng)分的影響要大于CRP與ESR。

3 討論

RA是一種病因未明的慢性、炎癥性疾病，其可導(dǎo)致關(guān)節(jié)的損傷和功能喪失[9]。雖然RA的致死率相對(duì)較低，但會(huì)為患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[10]。目前使用的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(如CRP和ESR)反映RA疾病的活動(dòng)性，因?yàn)樗鼈冎皇情g接反映了局部炎癥的程度，特異度和靈敏度都不夠理想[11]。因此迫切需要尋找用于診斷和評(píng)估RA疾病活動(dòng)性的新血清標(biāo)志物。

60年代中期，S100蛋白作為一種神經(jīng)性蛋白在牛腦中被發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槠淇扇苡?00%飽和硫酸銨，所以被稱為S100蛋白[12]。鈣衛(wèi)蛋白屬于S100鈣結(jié)合蛋白家族，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、激活的巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板以及成纖維細(xì)胞[13]。在細(xì)胞內(nèi)，鈣衛(wèi)蛋白通過(guò)鈣依賴性方式促進(jìn)微管蛋白聚合并穩(wěn)定微管蛋白，從而促進(jìn)吞噬細(xì)胞遷移。在細(xì)胞外主要是從活化的或壞死的中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞中釋放，作為炎癥蛋白質(zhì)參與多種自身免疫性疾病的致病過(guò)程[14]。比如幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、多發(fā)性硬化癥、囊性纖維化和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[15]，鈣衛(wèi)蛋白主要是通過(guò)與Toll樣受體-4(Toll-like receptors-4,TLR-4)和晚期糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)結(jié)合而發(fā)揮作用，其還可加速軟骨基質(zhì)的鈣化和骨小梁的構(gòu)建，調(diào)節(jié)鈣離子吸收過(guò)程中的氧化還原反應(yīng)[16，17]。 Baillet 等[6]在2010年通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)鈣衛(wèi)蛋白在RA患者滑液中的表達(dá)水平較OA患者滑液中表達(dá)水平高10倍左右，提示鈣衛(wèi)蛋白可能參與了RA的發(fā)病過(guò)程。另外鈣衛(wèi)蛋白通過(guò)NF-κB(Nuclear factor kappa B)和p38MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase)途徑增強(qiáng)RA中炎癥因子的作用也得到證實(shí)[18]。有研究發(fā)現(xiàn)RA患者血清中鈣衛(wèi)蛋白水平不但可以用來(lái)評(píng)估RA患者的藥物治療效果，而且可以預(yù)測(cè)RA患者的疾病影像學(xué)相關(guān)進(jìn)展[19，20]。同時(shí)因?yàn)殁}衛(wèi)蛋白能直接反映RA患者滑膜和滑液的炎癥活動(dòng)，有研究者甚至認(rèn)為鈣衛(wèi)蛋白有成為新的RA疾病活動(dòng)生物標(biāo)志物的巨大潛力[21]。

本研究結(jié)果顯示，RA組血清鈣衛(wèi)蛋白顯著高于OA組和健康對(duì)照組，且RA患者血清鈣衛(wèi)蛋白水平與其腫脹關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)、疼痛關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)、ESR、DAS28評(píng)分相關(guān)，此結(jié)果與García-Arias等[21]結(jié)果基本一致,差異之處可能是由于我們樣本量不同所導(dǎo)致。之前有研究顯示RA患者血清鈣衛(wèi)蛋白與其抗-CCP抗體水平和RF-IgM水平相關(guān)[22]，但最新研究結(jié)果顯示RA患者血清鈣衛(wèi)蛋白水平與其RF-IgM水平相關(guān)，但是與抗-CCP抗體水平?jīng)]有相關(guān)性[21]。我們的研究結(jié)果亦顯示出RA患者血清鈣衛(wèi)蛋白水平與其RF-IgM水平相關(guān)，但是與抗-CCP抗體水平不相關(guān)。不同研究結(jié)果的出現(xiàn)可能與我們選擇的患者接受了不同的藥物治療有關(guān)。因此RA患者鈣衛(wèi)蛋白血清水平與其抗-CCP、RF-IgM水平之間的相關(guān)性，還需要進(jìn)行更大樣本的深入研究，從而進(jìn)一步對(duì)相關(guān)結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。從ROC曲線結(jié)果可以看出鈣衛(wèi)蛋白血清水平對(duì)于診斷RA 的AUC為0.820，對(duì)于RA的診斷具有中等價(jià)值。綜上所述，血清鈣衛(wèi)蛋白對(duì)于RA的診斷，尤其是與OA的鑒別診斷具有一定意義。同時(shí)RA患者血清鈣衛(wèi)蛋白血清水平與其28 SJC、28 TJC、DAS28評(píng)分、RF-IgM、ESR相關(guān)。并且血清鈣衛(wèi)蛋白水平與DAS28疾病活動(dòng)度評(píng)分的相關(guān)性要明顯優(yōu)于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)CRP、ESR。表明鈣衛(wèi)蛋白很有希望成為新的診斷與監(jiān)測(cè)RA患者疾病活動(dòng)性的生物標(biāo)志物。但是由于本研究只進(jìn)行了橫向的觀察性研究，同時(shí)樣本含量相對(duì)較小，相關(guān)結(jié)論還需要更大樣本的深入研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，還需進(jìn)一步對(duì)鈣衛(wèi)蛋白作為RA患者預(yù)后評(píng)估，藥物療效預(yù)測(cè)以及治療靶點(diǎn)的可能性進(jìn)行探索。