液體發(fā)酵高產(chǎn)靈芝多糖培養(yǎng)基的篩選與配方優(yōu)化

馮東英 楊 寧 劉 爽 戴洪琨 賈傳福 杜新永

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城252000）

靈芝（Ganoderma lucidum）屬擔(dān)子菌綱多孔菌目多孔菌科靈芝屬，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌，具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道表明，靈芝多糖是靈芝中最重要的活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等[1-3]多種功效。而且，毒理學(xué)臨床實(shí)驗(yàn)表明，靈芝多糖不會(huì)對(duì)人體健康造成負(fù)面影響[4]。

培養(yǎng)基對(duì)于靈芝菌絲生長(zhǎng)、多糖產(chǎn)量有顯著的影響。靈芝液體深層發(fā)酵，一般選擇蛋白胨、酵母泥、麩皮、米糠[5-8]等作為培養(yǎng)基，也有采用中藥渣[9]，均取得了不錯(cuò)的結(jié)果。試驗(yàn)選擇了酵母泥、黃豆粉、玉米粉、麩皮以及中藥藥渣作為培養(yǎng)基主要成分，對(duì)靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳的靈芝多糖高產(chǎn)配方。

1 材料與方法

1.1 供試材料

靈芝菌種（泰山赤芝），由山東聊城冠縣靈芝栽培基地提供；蛋白胨為國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品，自購(gòu)；中藥渣由青島潤(rùn)達(dá)生物科技有限公司提供；酵母泥由杭州美亞生物科技有限公司提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

靈芝基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，去離子水1000 mL。

供試培養(yǎng)基（酵母泥、玉米粉、黃豆粉、麩皮、雜木屑、黃芪藥渣、甘草藥渣、金銀花藥渣）按干重20 g/L的量添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，為保證發(fā)酵效果，保留5 g/L的蛋白胨，其他成分比例不變。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同培養(yǎng)基液體發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)

將試管菌種接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基（500 L錐形瓶，裝入液體培養(yǎng)基200 mL）中，25℃搖瓶培養(yǎng)3 d后，作為種子培養(yǎng)基，按5%接種量，分別接入試驗(yàn)培養(yǎng)基中（500 L錐形瓶，裝液量200 mL），相同條件下培養(yǎng)3 d。

1.3.2 培養(yǎng)基正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)1.3.1試驗(yàn)結(jié)果，按照來(lái)源廣泛、物美價(jià)廉的原則，選擇黃豆粉、酵母泥、葡萄糖進(jìn)行三因素、三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 發(fā)酵液pH

pH檢測(cè)采用玻璃電極檢測(cè)。

1.4.2 菌絲球個(gè)數(shù)的統(tǒng)計(jì)

用剪掉尖頭的5 mL移液槍?zhuān)“l(fā)酵完成（72 h）的靈芝發(fā)酵液10 mL，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中計(jì)數(shù)。

1.4.3 菌絲體生物量

離心（3000×g，20 min）后，50℃烘干沉淀，減去對(duì)照值后計(jì)算。

1.4.4 靈芝多糖的提取與得率計(jì)算

靈芝多糖提取采用熱水浸提，噴霧干燥后測(cè)定得率。取干燥的靈芝菌絲體100 g，加1000 mL水，煮沸后維持1 h，離心（3000×g，20 min）去掉沉淀后，上清液噴霧干燥（進(jìn)風(fēng)口175℃、出風(fēng)口80℃、處理速度240 mL/h）。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

生長(zhǎng)指標(biāo)相關(guān)性分析、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、單因素顯著性分析等，均用SPSS完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試培養(yǎng)基靈芝液體培養(yǎng)結(jié)果

從靈芝液體深層發(fā)酵的生產(chǎn)指數(shù)來(lái)看，發(fā)酵液pH的下降是靈芝菌絲開(kāi)始迅速生長(zhǎng)的重要指標(biāo)之一，但是，pH的下降以及發(fā)酵結(jié)束的pH與靈芝多糖的得率之間的相關(guān)性不強(qiáng)。從表1中可以看出，pH下降速度最快的分別是麩皮、玉米粉，但是麩皮培養(yǎng)基的靈芝多糖得率低于基礎(chǔ)培養(yǎng)基（77%，按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基為100%，下同），玉米粉培養(yǎng)基的靈芝多糖得率略高于基礎(chǔ)培養(yǎng)基（108%）。郭天龍采用米糠、麩皮作為主要原料液體培養(yǎng)靈芝，獲得10.37 g/L的菌絲體生物量，4.279 g/L、7.644 g/L的胞內(nèi)和胞外靈芝多糖[5]。試驗(yàn)多糖得率較低，可能與發(fā)酵液pH下降太快有關(guān)系。程秀芳等對(duì)六株來(lái)源于不同地區(qū)的靈芝菌株同條件液體發(fā)酵，確定了pH3.5～4.5，鏡檢菌絲出現(xiàn)少量自溶點(diǎn)時(shí)作為發(fā)酵終點(diǎn)，此時(shí)靈芝胞內(nèi)多糖含量最高[10]。

試驗(yàn)發(fā)酵結(jié)束后，不同培養(yǎng)基的最終pH在4.39～5.23，靈芝多糖得率較高的黃豆粉（145%）、酵母泥（123%）培養(yǎng)基的最終pH均在4.8左右。張曉云采用酵母浸粉為主要原料培養(yǎng)龍芝一號(hào)，獲得了6.28 g/L的菌絲體生物量和1.68 g/L的胞內(nèi)靈芝多糖[7]。陳功明選擇了酵母粉作為主要培養(yǎng)基，培養(yǎng)赤芝，獲得了11.26 g/L的菌絲體生物量和1.63 g/L的胞內(nèi)靈芝多糖[5]。從表1中可以看出，試驗(yàn)采用酵母泥作為主要培養(yǎng)基成分時(shí)，獲得了9.04 g/L的菌絲體生物量，以及1.89 g/L的靈芝多糖，與上述文獻(xiàn)報(bào)道具有一定的吻合度，說(shuō)明酵母泥是靈芝深層發(fā)酵的優(yōu)選培養(yǎng)基之一。

從表1的數(shù)據(jù)可以看出，試驗(yàn)最佳的培養(yǎng)基為黃豆粉，同樣培養(yǎng)條件下，獲得了13.09 g/L的菌絲體生物量和2.24 g/L靈芝多糖。

2.2 靈芝菌絲生長(zhǎng)性狀與多糖得率相關(guān)性分析

結(jié)合表1的數(shù)據(jù)以及相關(guān)報(bào)道[8]，可以看出靈芝發(fā)酵過(guò)程中，菌絲球的個(gè)數(shù)與靈芝菌絲體生物量、靈芝多糖得率具有較好的相關(guān)性。喬雙逵等觀察分析了靈芝深層發(fā)酵時(shí)，菌絲球的大小及個(gè)數(shù)與菌絲體產(chǎn)量、靈芝多糖得率關(guān)系，結(jié)論是中小型菌球比例較高時(shí)有利于胞外多糖的合成，并且小型菌球比例大于大型菌球時(shí)，發(fā)酵液中多糖含量較高[12]。

由圖1、表2可見(jiàn)，菌絲球個(gè)數(shù)、菌絲體生物量、靈芝多糖得率三者之間均具有較好的正向相關(guān)性。以靈芝多糖得率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，則菌絲體生物量與靈芝多糖得率具有極顯著的相關(guān)性（0.829）、而菌絲球個(gè)數(shù)與靈芝多糖得率也具有顯著的相關(guān)性（0.789），皮爾森（Person）雙尾檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為（P＜0.01）。

圖1 靈芝菌絲生長(zhǎng)性狀與多糖得率相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

表1 供試培養(yǎng)基靈芝液體培養(yǎng)結(jié)果

表2 靈芝菌絲生長(zhǎng)性狀與多糖得率相關(guān)性分析

2.3 正交法優(yōu)化培養(yǎng)基配方

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，去掉培養(yǎng)基中的蛋白胨成分，選擇黃豆粉、酵母泥、葡萄糖作為靈芝深層發(fā)酵的主要培養(yǎng)基，同時(shí)參照1.3.1“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”添加相應(yīng)的無(wú)機(jī)鹽，利用SPSS進(jìn)行培養(yǎng)基正交優(yōu)化設(shè)計(jì)。因素水平見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)的因素水平

按照表4的正交方案進(jìn)行試驗(yàn)，記錄靈芝多糖的得率。極差分析方法結(jié)論是，靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中，對(duì)靈芝多糖產(chǎn)量的影響因素次序是黃豆粉＞葡萄糖＞酵母泥，最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A3B1C3，即：黃豆粉15 g/L，酵母泥5 g/L，葡萄糖20 g/L，添加 KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，初始pH為6.0左右。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

參照上述配方，按照1.3.1所述條件搖瓶培養(yǎng)靈芝，最終的靈芝多糖得率為4.99%，略低于表4中試驗(yàn)4，可能跟試驗(yàn)操作的誤差有關(guān)。

表5的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果與表4的極差分析結(jié)果基本相同，其中，黃豆粉用量的顯著性為0.007，符合P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)，即黃豆粉用量對(duì)靈芝多糖的產(chǎn)量具有顯著性影響；而葡萄糖、酵母泥用量的顯著性檢驗(yàn)值均高于0.05，即這兩種培養(yǎng)基對(duì)于靈芝多糖的最終得率不具有顯著性影響。

表5 主旨間效果檢定（響應(yīng)值：靈芝多糖得率/%）

綜上所述，結(jié)合經(jīng)濟(jì)性的原則，在盡量減少培養(yǎng)基用量的情況下，獲得最大的產(chǎn)出，試驗(yàn)最終確定的培養(yǎng)基配方為表4的第4個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即黃豆粉10 g/L，酵母泥5 g/L，葡萄糖10 g/L，添加KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

依照上述配方，利用100 L發(fā)酵罐進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（26℃、發(fā)酵72 h），最終收獲靈芝多糖130 g，固體投料量為2650 g，折合靈芝多糖得率為4.9%。

3 小結(jié)

靈芝液體發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液pH的降低是靈芝菌絲開(kāi)始迅速生長(zhǎng)的標(biāo)志，但是pH的變化與靈芝多糖的得率沒(méi)有相關(guān)性。靈芝菌絲球個(gè)數(shù)與菌絲體生物量與靈芝多糖的得率有著顯著的正相關(guān)性（0.789，0.829），說(shuō)明提高靈芝液體發(fā)酵過(guò)程中菌絲球數(shù)量可以提高靈芝多糖的得率。

黃豆粉、酵母泥都是靈芝液體培養(yǎng)獲取多糖良好培養(yǎng)基；試驗(yàn)中采用的中藥渣對(duì)于靈芝菌絲的生長(zhǎng)均有一定的抑制效果，發(fā)酵效果不理想。

經(jīng)過(guò)正交優(yōu)化，得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：黃豆粉 10 g/L，酵母泥 5 g/L，葡萄糖 10 g/L，添加KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。100 L發(fā)酵罐進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（26℃、發(fā)酵72 h），最終收獲靈芝多糖噴霧干燥粉130 g（得率4.9%）。