猴頭菌粉對(duì)小鼠急性酒精性胃損傷的預(yù)防作用

毛湘君芝 陸震鳴 耿燕 許泓瑜 袁峰 趙伏梅 徐國華 史勁松 許正宏，3

（1江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫214122；2江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；3江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；4江蘇神華藥業(yè)有限公司，江蘇淮安211600）

猴頭菌（Hericium erinaceus），又稱猴頭菇，隸屬于擔(dān)子菌門、猴頭菌科、猴頭菌屬，是著名的藥食兩用真菌。根據(jù)《本草綱目》和《中華本草》記載，猴頭菌性平、味甘，有“利五臟、助消化”的功能[1-2]。猴頭菌脂肪含量低，富含蛋白質(zhì)、多糖和膳食纖維。它也是必需氨基酸、酚類化合物和微量營養(yǎng)素的良好來源[3]?，F(xiàn)代研究表明，猴頭菌的子實(shí)體、菌絲體及其提取物有多種生物學(xué)活性，如保護(hù)胃腸道、抗腫瘤、降糖降壓、保肝、抗衰老、抗菌和神經(jīng)保護(hù)作用[4]。目前臨床上主要用于治療胃和十二指腸潰瘍、慢性胃炎和消化道腫瘤等[5-6]。

袋料栽培是目前人工栽培猴頭菌子實(shí)體最常用的方法，但這種方法生產(chǎn)周期長、費(fèi)用較高、且可能存在潮次不穩(wěn)定的現(xiàn)象。而將液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于猴頭菌的生產(chǎn)，能縮短生產(chǎn)周期、降低成本、提高產(chǎn)品穩(wěn)定性，并且易于實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)。目前，關(guān)于猴頭菌子實(shí)體及其提取物的藥效評(píng)價(jià)相關(guān)研究越來越多，但對(duì)液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)猴頭菌絲粉的護(hù)胃功能研究較少。筆者旨在探討猴頭菌粉對(duì)小鼠急性酒精性胃損傷的預(yù)防作用，為猴頭菌粉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

猴頭菌粉由江蘇神華藥業(yè)有限公司采用深層液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)，符合國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[7]；西咪替丁購于青島捷世康生物科技有限公司。

試驗(yàn)動(dòng)物：6周齡雄性C57BL/6小鼠，18～22 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

蘇木素伊紅染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程有限公司）；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）；TRIzol試劑（美國Roche公司）；SYBR Select Master Mix（美國Thermo公司）；微量pH計(jì)（Mettler Toledo公司）；RM2245半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國Leica公司）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 動(dòng)物模型的建立和樣品的采集

雄性C57BL/6小鼠48只，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，共6組，每組8只。空白組、模型組小鼠灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液；陽性組藥物為西咪替丁，給藥劑量為100 mg/kg；猴頭菌粉低、中、高劑量組分別為 125 mg/kg、250 mg/kg、500 mg/kg，所有藥物均溶于0.5%CMC-Na溶液中。每日灌胃給藥1次，連續(xù)6 d，第6天給藥后禁食24 h，不禁水。第7天除空白組外，其他各組給藥90 min后用無水乙醇0.1 mL/10 g灌胃，4 h后處死，取胃組織用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 胃液pH的測定

用微量pH計(jì)測量小鼠胃液pH。

1.5 胃黏膜損傷情況的肉眼觀察

將小鼠全胃沿胃大彎剪開，用冷生理鹽水漂洗內(nèi)容物。將胃組織攤平，胃內(nèi)表面朝上，對(duì)胃黏膜的損傷情況進(jìn)行肉眼觀察，評(píng)價(jià)胃黏膜完整性及出血情況。

1.6 胃黏膜組織病理學(xué)檢查

將小鼠胃組織置于10%甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，將其切成4μm薄片。用蘇木素伊紅染色試劑盒染色，中性樹膠封片，然后在顯微鏡下觀察。根據(jù)胃黏膜細(xì)胞脫落（0～3分）、出血（0～4分）、水腫（0～4分）、炎細(xì)胞浸潤（0～3分）情況進(jìn)行評(píng)分[8]。

1.7 胃組織中丙二醛（MDA）的測定

取小鼠胃組織，用丙二醛（MDA）測定試劑盒檢測MDA含量。具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.8 胃組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）mRNA表達(dá)量的測定

用TRIzol試劑提取小鼠胃組織RNA，用cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Mix試劑和特異性引物進(jìn)行qRT-PCR。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

引物序列如下：TNF-α上游引物5′-GACCCCTTTACTCTGACCCC-3′，下游引物5′-AGGCTCCAGTGAATTCGGAA-3′；IL-1β上游引物5′-ACTCATTGTGGCTGTGGAGA-3′，下游引物5′-TTGTTCATCTCGGAGCCTGT-3′；GAPDH 上游引物5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

qRT-PCR反應(yīng)體系：上游引物（5μmol/L），0.425μL；下游引物（5μmol/L），0.425μL；cDNA，1.25 μL；SYBR Green Mix，8.5 μL；RNase-free H2O，6.4 μL。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性，10 min，95°C變性，15 s，60°C退火，30 s，60°C 延伸，30 s，共 40個(gè)循環(huán)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠胃黏膜的肉眼觀察

小鼠胃壁內(nèi)部胃黏膜如圖1所示。正常組小鼠胃黏膜光澤紅潤，完整無損傷（圖1a）。乙醇灌胃后模型組小鼠胃黏膜表面有明顯出血、損傷潰爛（圖1b）。猴頭菌粉低、中、高劑量組以及陽性組，胃黏膜有部分出血，但損傷程度減輕（圖1c-f）。

圖1 猴頭菌粉對(duì)小鼠胃黏膜損傷程度的影響

2.2 小鼠胃黏膜的組織病理學(xué)觀察

圖2 猴頭菌粉對(duì)小鼠胃黏膜組織病理學(xué)變化的影響

表1 胃黏膜組織病理學(xué)變化各項(xiàng)得分

正常組小鼠胃黏膜各層結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞形態(tài)完整，腺體排列規(guī)則，未見組織缺損、出血、炎癥等異常病變（圖2a）。模型組小鼠黏膜層細(xì)胞彌散性壞死脫落情況嚴(yán)重，黏膜層中可見大量紅細(xì)胞，細(xì)胞腫大、排列松散，有炎細(xì)胞浸潤（圖2b）。陽性組小鼠部分黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，部分細(xì)胞排列松散，黏膜層中有少量紅細(xì)胞，有少量炎細(xì)胞浸潤（圖2c）。猴頭菌粉低、中、高劑量組小鼠胃黏膜形態(tài)與模型組相比都有不同程度改善（圖2d-f）。對(duì)小鼠胃黏膜細(xì)胞脫落、出血、水腫、炎細(xì)胞浸潤情況分別進(jìn)行評(píng)分（表1），分?jǐn)?shù)越高表明損傷越嚴(yán)重。猴頭菌粉低、中、高劑量組胃黏膜組織病理學(xué)變化各項(xiàng)得分之和分別為8.00±0.13、7.75±0.17、5.50±0.09，與模型組（9.63±0.06）相比分別降低了16.93%、19.52%、42.89%（圖3）。其中高劑量組差異最顯著（P＜0.001），胃黏膜形態(tài)更接近正常組。

圖3 胃黏膜組織病理學(xué)變化評(píng)分

圖4 猴頭菌粉對(duì)小鼠胃液pH的影響

2.3 小鼠胃液pH

如圖4，模型組小鼠胃液pH為6.33±0.06，與正常組有顯著性差異（P＜0.001），表明乙醇會(huì)對(duì)胃液pH產(chǎn)生影響。而陽性組、猴頭菌粉低中高劑量組小鼠胃液pH為6.79±0.03、6.67±0.04、6.76±0.06、6.88±0.03，與模型組沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 小鼠胃組織中MDA含量

模型組小鼠胃組織中MDA含量達(dá)到（5.46±0.10）nmol/mg，是正常組的2.45倍。表明酒精能使小鼠胃組織中MDA含量大幅度增加，引起組織損傷。而陽性組、猴頭菌粉低、中、高劑量組小鼠胃組織中MDA含量分別為（4.55±0.08）nmol/mg、（4.97±0.15）nmol/mg、（4.77±0.09）nmol/mg、（4.53±0.13）nmol/mg，比模型組略少，但沒有顯著性差異（P＞0.05）（圖5）。表明猴頭菌粉對(duì)酒精引起的MDA含量增加有一定的緩解作用。

圖5 猴頭菌粉對(duì)小鼠胃組織中MDA的影響

2.5 小鼠胃組織TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá)量

模型組、陽性組、猴頭菌粉低、中、高劑量組小鼠胃組織中，TNF-α mRNA表達(dá)量分別是正常組的11.6、5.6、5.9、5.3和4.3倍（圖6a、b）。與模型組相比，猴頭菌粉低、中、高劑量小鼠胃組織中TNF-α mRNA表達(dá)量分別下降了49.0%、54.6%、63.1%，差異顯著（P＜0.05）。模型組、陽性組、猴頭菌粉低、中、高劑量組小鼠胃組織中，IL-1β mRNA表達(dá)量分別是正常組的6.8、3.0、4.9、3.8和3.5倍。與模型組相比，猴頭菌粉低、中、高劑量小鼠胃組織中IL-1β mRNA表達(dá)量分別下降了27.8%、43.9%、48.3%。

圖6 猴頭菌粉對(duì)小鼠胃組織TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)量的影響

3 小結(jié)與討論

采用無水乙醇灌胃導(dǎo)致的小鼠急性胃損傷模型，探究猴頭發(fā)酵菌粉對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用。該模型制作簡便、成模速度快，其損傷特點(diǎn)、愈合過程與人胃黏膜損傷類似[9]。

酒精引起的胃損傷常伴有氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。丙二醛是由多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的，是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。因此，脂質(zhì)過氧化程度及機(jī)體的氧化應(yīng)激水平可以通過組織中丙二醛的含量進(jìn)行評(píng)估。此外，研究表明，酒精會(huì)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)從而影響促炎因子的水平，包括TNF-α和IL-1β[10]。TNF-α作為一種具有多種功能的重要細(xì)胞因子，與其他炎癥因子（如IL-1β和IL-6）的活化密切相關(guān)，參與炎性疾病的發(fā)展[11]。而IL-1β和IL-6的激活會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α的表達(dá)，加劇炎癥反應(yīng)。TNF-α是致炎最強(qiáng)的因子之一，因此常作為判斷炎癥程度的指標(biāo)。

以不同劑量的猴頭菌粉連續(xù)灌胃小鼠6 d后，觀察乙醇灌胃后小鼠胃黏膜的損傷情況。檢測小鼠胃液pH、胃組織MDA含量、TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá)情況，結(jié)合胃組織病理學(xué)檢查，評(píng)價(jià)猴頭菌粉對(duì)急性酒精性胃損傷的保護(hù)作用，初步探究猴頭菌粉保護(hù)胃黏膜的機(jī)制。結(jié)果表明，模型組小鼠胃黏膜可見明顯出血、潰爛、細(xì)胞壞死脫落情況，胃液pH明顯升高，胃組織MDA含量顯著增加，胃組織中TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)量明顯增加。灌胃猴頭菌粉能顯著改善小鼠胃黏膜中出血、潰爛、細(xì)胞壞死脫落情況，胃組織MDA含量略有下降，但對(duì)酒精引起的pH升高沒有顯著影響。而小鼠胃組織中TNF-α和IL-1β mRNA含量明顯少于模型組，提示猴頭菌粉可能通過抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)，減少酒精對(duì)胃黏膜的損傷，達(dá)到保護(hù)胃黏膜的效果。