基于線粒體功能障礙探討中醫(yī)藥治療心肌缺血再灌注的研究思路?

楊麗華，馬 春，李淑玲，劉抒雯

(1. 長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130000； 2. 長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130000)

急性心肌梗死(AMI)已成為威脅人類健康的疾病之一[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示[2]，我國AMI的發(fā)病率為45/10～55/10萬。當(dāng)心肌短暫缺血后血流灌注恢復(fù)，而復(fù)灌后缺血和組織損傷，進(jìn)一步加重甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象，這一反應(yīng)稱為缺血-再灌注損傷(MIRI)[3-4]。目前的治療措施在治療AMI的同時帶來MIRI損傷。因此，MIRI發(fā)病后重視其發(fā)病機(jī)制，并進(jìn)行早期干預(yù)，采取有效措施治療，對減輕MIRI損傷、防止并發(fā)癥發(fā)生及降低死亡率顯得尤為重要。

研究顯示[5]，線粒體損傷是心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能障礙的基本環(huán)節(jié)，其功能障礙是MIRI損傷的重要病理機(jī)制之一。線粒體功能障礙引起MIRI損傷，主要包括線粒體ATP生成減少、Ca2+超載、活性氧(ROS)大量產(chǎn)生及線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)持續(xù)開放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6-9]，加重MIRI損傷。前期研究表明[10-11]，中醫(yī)藥在MIRI損傷時能抑制線粒體電子傳遞鏈，調(diào)節(jié)線粒體能量代謝，抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮肌細(xì)胞保護(hù)作用，可作為抗心肌缺血的藥物靶點(diǎn)。筆者擬對MIRI損傷后線粒體的結(jié)構(gòu)功能改變及中醫(yī)藥對其具體調(diào)節(jié)作用機(jī)制進(jìn)行綜述，為中醫(yī)藥干預(yù)線粒體的病理過程提供治療思路，對改善急性心肌梗死患者臨床及預(yù)后具有重要意義。

1 MIRI損傷后線粒體結(jié)構(gòu)功能變化及其損傷機(jī)制

1.1 心肌缺血后線粒體的變化及其損傷機(jī)制

線粒體功能障礙是導(dǎo)致心肌損傷的使動環(huán)節(jié)[12]。在MIRI損傷后，細(xì)胞內(nèi)線粒體穩(wěn)態(tài)平衡被打破，大量ROS釋放，引起ATP合成減少，使一些ATP依賴酶類如Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)功能障礙。同時細(xì)胞內(nèi)pH下降、H+增多，導(dǎo)致Na+-H+交換增多，細(xì)胞內(nèi)Na+異常增多，激活Na+/Ca2+交換蛋白(NCX)的反向模式，使胞內(nèi)Ca2+超載，磷酸鹽濃度增加，mPTP開放與激活導(dǎo)致線粒體外膜破裂發(fā)生不可逆損傷，引起細(xì)胞色素C(Cytc)釋放，通過Caspases等凋亡因子依賴機(jī)制細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過程，加重心肌損傷[13-15]。因此，當(dāng)MIRI損傷時，線粒體的損傷情況在一定程度上決定了心肌細(xì)胞死亡數(shù)量，直接決定著患者的能否存活及生存質(zhì)量。

1.2 線粒體與ROS

線粒體是氧化代謝、能量生成的場所，其呼吸功能與細(xì)胞活性密切相關(guān)。正常條件下，心肌細(xì)胞線粒體低濃度的ROS控制心肌細(xì)胞分化和興奮-收縮偶聯(lián)，不會導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的損害[16]。當(dāng)心肌細(xì)胞在缺血缺氧的條件下，ROS能夠引起蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化，重新激活線粒體電子傳遞鏈，引起氧自由基的清除系統(tǒng)功能降低，破壞心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，同時破壞心肌細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜的流動性及通透性，使DNA、RNA交聯(lián)甚至斷裂及心肌細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)均受到影響[17-19]。此外，ROS的大量產(chǎn)生還引發(fā)Ca2+超載以及mPTP開放，導(dǎo)致Cyt-c 等一系列促凋亡因子的釋放，通過凋亡的級鏈反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡[20]。因此改善心肌缺血血供、降低氧耗、清除或?qū)褂泻ξ镔|(zhì)對心肌的不良影響，以保護(hù)心肌線粒體是提供心肌細(xì)胞能量的主要場所。

1.3 線粒體與鈣超載

生理情況下，線粒體對鈣離子的攝取主要是通過依靠作為其主要動力之一的心肌線粒體膜電位(ΔΨm)幫助實(shí)現(xiàn)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。1972年Shen和Jennings[22]發(fā)現(xiàn)，犬心臟冠狀動脈短暫閉塞后復(fù)灌可加速細(xì)胞內(nèi)Ca2+的積聚，使Ca2+在心肌缺血再灌注損傷中的作用成為人們研究的重點(diǎn)。研究表明[23-24]，當(dāng)Ca2+的濃度發(fā)生增加幅度稍高，會促使發(fā)生氧化磷酸化線粒體現(xiàn)象，一定程度上刺激線粒體基質(zhì)的Ca2+攝入，Ca2+量明顯增加，Ca2+超載發(fā)生于線粒體基質(zhì)中，則會發(fā)生消除ΔΨm效應(yīng)。當(dāng)再灌注時心肌細(xì)胞重新恢復(fù)氧供，細(xì)胞內(nèi)Ca2+促進(jìn)黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，使ROS生成增多，加重酸中毒，大量乳酸堆積反過來使線粒體膜通透性改變，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，線粒體內(nèi)Ca2+以磷酸鹽形式沉積，影響線粒體的氧化磷酸化過程，同時膜磷脂的降解釋放大量產(chǎn)物如花生四烯酸、溶血磷脂，增加膜通透性，加重了線粒體內(nèi)Ca2+超載[25-26]，使心肌功能進(jìn)一步損傷。因此，減輕或防止線粒體 Ca2+超載和線粒體損傷，對保護(hù)缺血再灌注心肌細(xì)胞有重要意義。

1.4 線粒體與線粒體膜通透性轉(zhuǎn)移孔MPTP

mPTP是位于線粒體內(nèi)的非選擇性、高導(dǎo)電性復(fù)核孔道[27]，是線粒體進(jìn)行氧化應(yīng)激、細(xì)胞呼吸、合成ATP等生命活動的必要條件，也是影響線粒體穩(wěn)定性和細(xì)胞功能的關(guān)鍵因素[28]。當(dāng)外界刺激較輕時，少量線粒體上mPTP一過性開放，線粒體內(nèi)Ca2+釋放，ATP仍可由部分未受損的線粒體提供。嚴(yán)重?fù)p傷時，高通透性開放狀態(tài)使 ATP合成受阻，線粒體膜電位下降、細(xì)胞色素C等前凋亡蛋白釋放[29]，不可逆的MIRI損傷與mPTP的激活開放密切相關(guān)[30]。在MIRI早期，ATP合成分解障礙使線粒體膜上的mPTP進(jìn)一步開放。同時，呼吸鏈與氧化磷酸化解偶聯(lián)，線粒體跨膜電位消失，H+自由在線粒體內(nèi)膜兩側(cè)達(dá)到平衡，破壞線粒體質(zhì)子梯度、膜電位消失，引起線粒體內(nèi)離子平衡紊亂，引起外滲的細(xì)胞色素可活化，可活化凋亡執(zhí)行蛋白并最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞調(diào)亡[31-32]。因此，在MIRI早期有效抑制線粒體mPTP的開放，可作為MIRI損傷新的治療策略。

1.5 線粒體與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡病理?xiàng)l件下可促進(jìn)細(xì)胞死亡[33]。細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的主要原因和表現(xiàn)形式之一，線粒體在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[34]。線粒體在凋亡信號的刺激下，通透性增大，膜電位丟失，促進(jìn)凋亡因子從線粒體釋放到胞質(zhì)中，細(xì)胞凋亡裂解所釋放的ROS又引起鄰近細(xì)胞的連鎖式凋亡反應(yīng)。此外，線粒體內(nèi)鈣超載及ROS 的集聚導(dǎo)致mPTP大量開放，線粒體內(nèi)膜完整性破壞，ATP合成功能障礙，促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子釋放，加重心肌缺血再灌注損傷，因此線粒體功能障礙與否與心肌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。當(dāng)MIRI損傷后產(chǎn)生的ROS、Ca2+超載等病理變化以及線粒體損傷引起的mPTP開放，線粒體跨膜電位持續(xù)性降低，使線粒體向胞質(zhì)釋放凋亡因子Cyt-c和Smac(second mitochondrial-derived activator of caspase)等凋亡信號啟動，這些因素雖然不能直接引起細(xì)胞凋亡，但可通過一定的信號傳遞方式激活生存或死亡相關(guān)基因，執(zhí)行死亡功能[35-37]。

2 中醫(yī)藥對心肌缺血后線粒體功能的保護(hù)作用及機(jī)制

2.1 以線粒體整體功能為關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的中藥單體及復(fù)方

在MIRI損傷過程中，Ca2+超載和活性氧大量產(chǎn)生會造成mPTP不可逆開放。治療過程中，抑制mPTPT的激活與開放對維持線粒體穩(wěn)態(tài)對防治MIRI具有重要意義。范宗靜等[38]建立MIRI大鼠模型后發(fā)現(xiàn)，模型組線粒體膜電位、mPTP的開放程度、線粒體鈣離子濃度及ROS水平均顯著升高，經(jīng)黃芪多糖處理后線粒體膜電位、mPTP的開放程度、線粒體鈣離子濃度及ROS水平明顯降低，證實(shí)黃芪多糖通過減輕線粒體內(nèi)鈣超載減少ROS產(chǎn)生，降低膜電位水平及抑制mPTP過度開放，從而減輕MIRI對線粒體膜結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而保護(hù)心臟舒縮功能。此外，體外細(xì)胞(HCMEC)也證實(shí)，黃芪多糖干預(yù)后AKT和ERK1/2介導(dǎo)的細(xì)胞傳導(dǎo)通路激活，進(jìn)一步證實(shí)黃芪多糖對MIRI后線粒體的整體保護(hù)作用[39]。周春剛[40]等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)處理缺氧心肌細(xì)胞，細(xì)胞早期凋亡率和ROS水平均明顯降低，表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠提高細(xì)胞耐受氧化應(yīng)激，抑制缺氧復(fù)氧損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。中醫(yī)藥從線粒體整體保護(hù)出發(fā)，通過抑制鈣超載，減少ROS產(chǎn)生，降低膜電位水平及抑制mPTP過度開放等多靶點(diǎn)治療，進(jìn)而保護(hù)心臟舒縮功能、維持心臟穩(wěn)態(tài)具有重要意義。

2.2 以線粒體內(nèi)鈣超載為關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的中藥單體及復(fù)方

MIRI損傷時，細(xì)胞中因缺血缺氧而進(jìn)行無氧糖降解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+外流、Ca2+內(nèi)流引起鈣超載[41]。朱寧等[42]發(fā)現(xiàn)，缺氧組心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA)活性下降，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，紅景天苷治療后，心肌細(xì)胞SERCA活性增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量顯著降低，說明紅景天對缺氧的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)可能與其能升高SERCA活性、減輕鈣超載有關(guān)。宋麗華等[43]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇組線粒體中琥珀酸脫氫酶(SDH)、鈉鉀腺苷三磷酸酶(Na+-K+-ATPase)、鈣腺苷三磷酸酶(Ca2+-ATPase)的活性明顯提高，線粒體內(nèi)鈣離子濃度明顯下降，mPTP開放程度減小，線粒體膜電位增高；Ca2+-ATPase、熱休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)在mRNA或蛋白水平上的表達(dá)均有所增加，證實(shí)白藜蘆醇保護(hù)MIRI可能是通過增加心肌組織中Ca2+-ATPase、HSP70mRNA蛋白的表達(dá)，從而提高線粒體Ca2+-ATPase的活性，產(chǎn)生對大鼠心肌缺血再灌注損傷時線粒體的保護(hù)作用。因此，中醫(yī)藥抑制Ca2+的作用機(jī)制可能與影響細(xì)胞膜上鈣通道的開放，干預(yù)Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase，提高心肌肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵活性及雙重細(xì)胞和線粒體鈣濃度，發(fā)揮心肌線粒體保護(hù)功能。

2.3 以線粒體內(nèi)氧自由基為關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的單體及復(fù)方

氧化應(yīng)激損傷在心肌缺血尤其是再灌注時起關(guān)鍵作用。王佳等[44]研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸可明顯減少心肌丙二醛(MDA)和脂質(zhì)過氧化物(LPO)的表達(dá)水平，以及血總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)含量，增加心肌過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及血清高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)的含量，提示熊果酸可通過抑制氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減輕ROS誘發(fā)的線粒體功能障礙，從而減輕MIRI損傷。關(guān)鳳英等[45]證實(shí)，黃芪甲苷能夠顯著降低MDA含量和乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量，增強(qiáng)SOD活力，并能改善細(xì)胞器形態(tài)，激活線粒體ATP敏感性鉀離子通道(mitoK ATPC)，使線粒體信號傳導(dǎo)通路受抑制，最終減少心肌細(xì)胞凋亡。保善錄等[46]用4味辣根菜湯散給藥后，大鼠SOD活性升高，MDA含量降低，其對MIRI損傷心肌的保護(hù)作用可能是通過促進(jìn)抑制自由基的產(chǎn)生，增強(qiáng)自由基清除劑的功能，從而維持心肌細(xì)胞氧化和抗氧化的動態(tài)平衡，發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞保護(hù)作用。因此，中醫(yī)藥針對氧化應(yīng)激的作用機(jī)制可能與抑制自由基產(chǎn)生、提高線粒體抗氧化能力損傷密切相關(guān)。

2.4 靶向線粒體內(nèi)mPTP的中藥單體及復(fù)方

mPTP異常高水平開放可導(dǎo)致能量生成障礙及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。李劍等[47]建立大鼠MIRI損傷模型后發(fā)現(xiàn)，再灌注期心肌細(xì)胞上的線粒體 mPTP呈開放狀態(tài)，給予葛根素治療后恰好能抑制線粒體mPTP的開放，減少心肌細(xì)胞Caspase-3的大量釋放，從而能抑制心肌細(xì)胞的大量凋亡，同時葛根素組的自噬特異性標(biāo)志物L(fēng)C3 II、Beclin1顯著減少，說明葛根素減少心肌缺血再灌注梗死面積，其可能的作用機(jī)制是抑制線粒體mPTP開發(fā)，從而減輕心肌細(xì)胞大量和自噬性死亡。賀永貴[48]等結(jié)扎冠狀動脈進(jìn)行心肌缺血建立離體MIRI模型，給予黃芪甲苷治療后心功能顯著改善，心肌梗死面積明顯減少，線粒體腫脹程度縮小，同時給藥后使再灌注5 min和10 min的GSK-3β磷酸化明顯增加，說明黃芪甲苷通過使GSK-3β失活而抑制mPTP，證實(shí)黃芪甲苷對MIRI保護(hù)作用可能與抑制GSK-3β 活性、進(jìn)而阻止mPTP開放有關(guān)。李玉紅等[49]將參麥注射液與丹參注射液聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，離體心臟mPTP更容易開放，表明其含有較多未開放的線粒體，提示其聯(lián)合應(yīng)用在體時可能減少誘發(fā)mPTP開放的因素，使再灌注期間活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生及線粒體鈣超載降低，從而“間接”抑制mPTP開放，減少其凋亡或壞死的發(fā)生，保護(hù)線粒體的完整性。中醫(yī)藥能夠以mPTP為靶點(diǎn)治療mIRI損傷，其具體作用機(jī)制可能與通過作用于mPTP結(jié)構(gòu)成分，直接抑制mPTP開放及通過降低mPTP開放誘導(dǎo)劑的水平間接抑制mPTP開放有關(guān)。

2.5 靶向線粒體內(nèi)細(xì)胞凋亡中藥單體及復(fù)方

線粒體內(nèi)細(xì)胞凋亡是MIRI損傷的最終結(jié)果，PI3K-Akt信號通路具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡等作用，是調(diào)控心肌細(xì)胞存活的一個重要通路[50]。張月紅[51]等在研究丹參飲提取物A抗心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，丹參飲提取物A組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比模型組明顯降低，Bcl-2、GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bax蛋白和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯降低，同時P-Akt蛋白表達(dá)增加，說明PI3K-Akt 信號通路參與了心肌缺血損傷的發(fā)生過程，丹參飲提取物對心肌缺血細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用可能是通過PI3K-Akt信號傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。于鑫鑫等[52]發(fā)現(xiàn)，甘草酸能顯著降低MIRI細(xì)胞凋亡率，減少腦組織MKK/JNK信號通路蛋白[絲分裂原活化蛋白激酶4/7(p-MKK4/7)]、c-Jun氨基末端激酶1/2/3(p-JNK1/2/3)、Caspase-8、Bax、Caspase-3表達(dá)，提高Bcl-2表達(dá)水平，同時甘草酸組較模型組心肌細(xì)胞水腫程度輕且炎性細(xì)胞少。林凱旋等[53]制備大鼠MIRI模型，觀察益氣化瘀方對心肌細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)益氣化瘀方能明顯減少促心肌細(xì)胞凋亡的相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白Bax、Caspase-3、Fas及P53的表達(dá)，增加抑制心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2的表達(dá)，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。因此，中醫(yī)藥能夠抑制細(xì)胞凋亡因子的產(chǎn)生，提高抗細(xì)胞凋亡因子活性，并通過調(diào)控多細(xì)胞間信號通路發(fā)揮抗凋亡作用。

3 思考與展望

基于線粒體的整體結(jié)構(gòu)完整和功能穩(wěn)定，對于MIRI治療提供了新的靶點(diǎn)及研究思路。中醫(yī)藥具有多組分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑的優(yōu)勢和特點(diǎn)，隨著中醫(yī)藥抗MIRI作用機(jī)制的深入研究，調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)功能被證實(shí)是中醫(yī)藥對心肌保護(hù)作用的機(jī)制之一。上述研究證實(shí)，中藥單體及復(fù)方均能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，減少Ca2+超載，穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)功能，抑制mPTP開放，最終抑制細(xì)胞凋亡而減輕MIRI損傷。但現(xiàn)有研究對線粒體結(jié)構(gòu)功能及中醫(yī)藥治療作用機(jī)制尚未深入研究及系統(tǒng)評價，以下問題有待解決：一是大多數(shù)仍停留在單一機(jī)制的研究，同一指標(biāo)多次檢測、同一中藥單體及復(fù)方反復(fù)驗(yàn)證，降低了中藥在治療MIRI的突出優(yōu)勢；二是在相關(guān)蛋白信號通道及基因等深層次方面研究較少，不能很好地體現(xiàn)中藥對MIRI作用機(jī)制的多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)特點(diǎn)；三是對中藥作用機(jī)制的研究大多借鑒西藥的研究模式，在中醫(yī)辨證方面的研究極少，忽視了中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)；四是實(shí)驗(yàn)動物模型的制備僅具有MIRI疾病的特征，而未按中醫(yī)學(xué)“證”出發(fā)，與辨證論治不相符，在臨床運(yùn)用中有一定的盲目性；五是未深入研究線粒體與其他組分間相互影響機(jī)制，中醫(yī)藥調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)及怎樣將現(xiàn)有的研究成果與臨床實(shí)際結(jié)合更好地解決實(shí)際應(yīng)用，可能都是今后需要研究和解決的問題。因此，基于中醫(yī)“整體觀念，辨證論治”的理論，開發(fā)療效確切的新藥，重視線粒體與其他影響MIRI組分之間的相互作用，將西醫(yī)辨病與中醫(yī)辨證相結(jié)合， 對病、 證、方藥有機(jī)結(jié)合研究，同時加強(qiáng)miRNA基因調(diào)控等細(xì)胞分子層面對線粒體代謝等基礎(chǔ)研究，探索其相關(guān)調(diào)控機(jī)制和信號分子改變，闡明其防治MIRI的物質(zhì)基礎(chǔ)和主要作用機(jī)制，在臨床研究中進(jìn)行更為科學(xué)的設(shè)計，擴(kuò)展更大的樣本量，進(jìn)行分類系統(tǒng)研究，提高對MIRI機(jī)制的研究，并能夠?yàn)榕R床治療MIRI提供潛在的治療策略和理論依據(jù)。