單細(xì)胞測序技術(shù)在實體瘤研究中的應(yīng)用進展

鄭小翠 綜述，汪希鵬 審校

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200092

腫瘤是由遺傳物質(zhì)異常引起的體細(xì)胞惡性克隆。為適應(yīng)宿主各種復(fù)雜的微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞在對原有突變基因進行優(yōu)勢選擇的同時，還不斷產(chǎn)生新的基因突變[1］，而這些攜帶不同“新基因”的腫瘤細(xì)胞將表現(xiàn)出不同的特性，在侵襲轉(zhuǎn)移能力和耐藥性等多方面有所差異，從而形成了瘤內(nèi)細(xì)胞異質(zhì)性。近年來，單細(xì)胞測序技術(shù)的出現(xiàn)為進一步鑒別腫瘤的異質(zhì)性提供了新的手段。對實體瘤及其微環(huán)境中單個細(xì)胞的基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀遺傳學(xué)進行測序分析，不僅能揭示瘤內(nèi)細(xì)胞異質(zhì)性，還能有效區(qū)分腫瘤微環(huán)境中的各細(xì)胞亞群，從而有利于研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥和免疫逃逸的相關(guān)機制。

1 單細(xì)胞測序技術(shù)概述

單細(xì)胞測序技術(shù)主要包括單細(xì)胞基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序和表觀遺傳學(xué)測序（圖1），它們各有優(yōu)勢和特點，能夠從不同角度揭示細(xì)胞的功能狀態(tài)。與以往樣本測序不同，我們需要先將實體組織或體液中的細(xì)胞群分離成單個細(xì)胞，再通過對提取的核酸（DNA或RNA）進行一定倍數(shù)的擴增使其達到現(xiàn)有測序技術(shù)的最低檢測水平[2］，用于基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，或直接對單個細(xì)胞進行表觀遺傳學(xué)測序。此外，單細(xì)胞多組學(xué)測序也正被逐漸應(yīng)用于各種實體瘤的研究中。

1.1 單細(xì)胞分離

單細(xì)胞分離是進行各種單細(xì)胞測序的首要步驟，主要方法有連續(xù)稀釋法、微量吸液管、流式細(xì)胞術(shù)、微流控技術(shù)、激光捕獲顯微切割術(shù)（laser-capture microdissection，LCM）等[3］。前兩者多用于少量目標(biāo)細(xì)胞的分離。流式細(xì)胞術(shù)可通過各種免疫熒光標(biāo)記對細(xì)胞進行分選，其中熒光激活細(xì)胞分選系統(tǒng)（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）較為常用[4］。微流控技術(shù)主要基于細(xì)胞自身特性（直徑、表面抗原、電極等）進行分離，試劑的使用少，但對設(shè)備要求高。LCM通過在顯微鏡下利用激光束對組織切片細(xì)胞進行分離，不需要細(xì)胞懸液，可以顯示細(xì)胞的空間位置，但細(xì)胞及核酸的完整性可能被破壞[5］。

1.2 單細(xì)胞基因組測序

單細(xì)胞基因組測序在對分離得到的單細(xì)胞進行DNA提取后，進一步對單細(xì)胞DNA進行全基因組擴增（whole-genome amplification，WGA），主要的方法有退行性寡核苷酸聚合酶鏈反應(yīng)（degenerate oligonucleotide-primed polymerase chain reaction，DOP-PCR）、多重置換擴增（multiple displacement amplification，M D A）、P i c o P L E X 和多重退火環(huán)狀循環(huán)擴增（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）等。其中，MDA對全基因組的覆蓋率高，多用于單核苷酸突變的檢測，而DOP-PCR和MALBAC對基因組擴增的均一性好，多用于基因拷貝數(shù)變異的檢測[4］。擴增后的基因組再通過DNA二代測序技術(shù)進行測序分析，最后準(zhǔn)確地檢測出多種不同類型的基因改變。

1.3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

基因組測序主要用于檢測DNA分子的異常，而轉(zhuǎn)錄組測序可直觀反映基因的表達情況，能更準(zhǔn)確地辨別處于不同狀態(tài)或發(fā)展階段的細(xì)胞。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在單細(xì)胞分離和RNA提取后，需要先將捕獲的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用PCR或體外轉(zhuǎn)錄（in vitro transcription，IⅤT）的方法進行全轉(zhuǎn)錄組擴增（whole-transcriptome amplification，WTA），最終進行測序分析。為提高測序結(jié)果的準(zhǔn)確性和實現(xiàn)高通量測序，許多測序技術(shù)在反轉(zhuǎn)錄時加入細(xì)胞特有的DNA條形碼和標(biāo)記各mRNA的特定分子標(biāo)識（UMIs），如STRT-seq、MARS-seq、CytoSeq和Drop-seq/InDrops[6］。

1.4 單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)測序

除了基因組本身，其表觀修飾也對基因的表達起著重要的調(diào)控作用，尤其是DNA甲基化。隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展，DNA甲基化的檢測也可在單細(xì)胞水平進行，目前最常用的技術(shù)是單細(xì)胞簡化代表性亞硫酸氫鹽測序（singlecell reduced-representation bisulfite sequencing，scRRBS），它主要通過對CpG富集區(qū)域（如CpG島）進行限制性消化和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，從而測序得到單個細(xì)胞全面的DNA甲基化水平[7］，間接地反映大部分基因的表達情況。

1.5 單細(xì)胞多組學(xué)平行測序

近年來，單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展使多組學(xué)同步測序分析成為了現(xiàn)實，有助于我們進一步探討各細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)三者之間的關(guān)系，研究實體瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的各種分子機制。例如，G&T-seq利用改良二代測序技術(shù)和各種WGA方法分別對全長mRNA和基因組DNA進行平行測序，同時獲得單個細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組信息，從而更好地研究基因與其表達水平之間的關(guān)系[8］；單細(xì)胞三重組學(xué)測序（single-cell triple omics sequencing，scTrio-seq）技術(shù)先將單細(xì)胞mRNA釋放形成上清液用于轉(zhuǎn)錄組測序，再通過scRRBS方法對含有基因組DNA的沉淀物進行DNA甲基化測序和基因拷貝數(shù)變異的檢測，最終得到單細(xì)胞基因組、DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組的測序數(shù)據(jù)，進而探索三者之間的復(fù)雜關(guān)系[9］。

2 單細(xì)胞測序與實體瘤研究

2.1 揭示瘤內(nèi)細(xì)胞的異質(zhì)性

隨著單細(xì)胞測序在實體瘤研究中的廣泛應(yīng)用，多項研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞通常由多個克隆亞群組成，它們具有不同的侵襲轉(zhuǎn)移、促血管生成能力，對機體免疫的應(yīng)答和化療藥的反應(yīng)也各有不同。2012年，Kreso等[10］通過對來自10例結(jié)直腸癌患者的150個腫瘤細(xì)胞進行單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)同一患者的各腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出不同的的生長動力學(xué)特征，對奧沙利鉑的反應(yīng)也不一致。2014年，Yu等[11］對1例結(jié)腸癌患者的腫瘤組織進行單細(xì)胞外顯子測序，檢測到兩個細(xì)胞亞群，大部分腫瘤細(xì)胞含有APC和TP53突變基因，小部分則以CDC27和PABPC1突變?yōu)橹?。同年，Patel等[12］通過對來自5例成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的430個腫瘤細(xì)胞進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)同一組織來源的腫瘤細(xì)胞在與致瘤信號通路、細(xì)胞增殖、免疫應(yīng)答和缺氧應(yīng)激相關(guān)的基因表達上均有較顯著的差異。2016年，Hou等[9］對來自1例肝細(xì)胞癌患者的25個腫瘤細(xì)胞進行單細(xì)胞多組學(xué)（基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)）測序，發(fā)現(xiàn)了兩個細(xì)胞亞群，數(shù)量少的一個細(xì)胞亞群檢測到更多的基因拷貝數(shù)變異，表達更多侵襲性細(xì)胞標(biāo)志物，更有可能逃避免疫監(jiān)視。

2.2 分析腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程

近些年，不少研究利用單細(xì)胞測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了許多與實體瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的新異常基因，還鑒別出一些在腫瘤發(fā)展中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞亞群。2016年，Yang等[13］通過對來自3例膀胱癌患者的腫瘤組織進行單細(xì)胞測序，在腫瘤干細(xì)胞群中檢測到6個與其發(fā)生相關(guān)的新基因，還發(fā)現(xiàn)ARID1A、GPRC5A和MLL2的共突變增強了腫瘤上皮非干細(xì)胞的自我更新能力并促使腫瘤的發(fā)生。同年，Tirosh等[14］對來自6例少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的4 347個腫瘤細(xì)胞進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了一群具有很強的增殖潛力并表達干細(xì)胞相關(guān)生物標(biāo)志物的腫瘤克隆亞群。這些通過單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)的新突變基因和關(guān)鍵腫瘤克隆亞群將可能成為腫瘤治療的潛在靶標(biāo)，有利于臨床上進一步探索攻克腫瘤的新方法。

此外，單細(xì)胞測序還有助于重建更加全面精確的腫瘤細(xì)胞系譜樹。以往的腫瘤細(xì)胞系譜樹建立通常是基于多細(xì)胞測序的數(shù)據(jù)，忽略了某些微量的突變基因，并將這些細(xì)胞粗略地并入其他克隆亞群中。而單細(xì)胞測序則幾乎能檢測到腫瘤細(xì)胞所有的突變基因，得到較完整的數(shù)據(jù)[15］。

2.3 闡明腫瘤轉(zhuǎn)移機制

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因之一，而通過對原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶及循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）進行單細(xì)胞測序分析，我們對實體瘤的轉(zhuǎn)移分子機制有了更深入的了解。2014年，Ting等[16］通過對來自胰腺癌小鼠的CTC和原發(fā)腫瘤灶進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞相關(guān)基因Aldh1a2和多富集于上皮-間質(zhì)界面的Igfbp5轉(zhuǎn)錄本在CTC中表達增加，同時，他們還對來源于胰腺癌患者的CTC進行單細(xì)胞測序分析，表明細(xì)胞外基質(zhì)基因在小鼠和人的CTC中都高表達，而這個基因被證實與胰腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。2015年，Lawson等[17］利用單細(xì)胞測序?qū)Σ煌制诘霓D(zhuǎn)移性乳腺癌進行基因表達分析，發(fā)現(xiàn)早期病變的轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞的基因表達水平與原發(fā)灶有顯著差異，而晚期病變則十分相似。同時，他們發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤存在一群微量的干細(xì)胞樣克隆亞群，也在早期病變的轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞中檢測到多種干細(xì)胞基因的表達，并證實這些細(xì)胞能分化產(chǎn)生體腔樣轉(zhuǎn)移細(xì)胞，從而闡明了干細(xì)胞樣克隆亞群在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用。2017年，Leung等[18］分別對2例結(jié)直腸癌患者的原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞進行單細(xì)胞基因組測序，并通過腫瘤細(xì)胞系進化分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腫瘤的肝轉(zhuǎn)移是由原發(fā)腫瘤細(xì)胞進化出傾向肝轉(zhuǎn)移的突變基因，再進行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而這個過程可以是單克隆或多克隆。

以上說明CTC及原發(fā)灶中干細(xì)胞樣克隆亞群是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。臨床上可以通過檢測這些CTC來判斷腫瘤是否發(fā)生了轉(zhuǎn)移或有轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的高風(fēng)險，從而盡早診治。Zhang等[19］在2014年就通過研究表明，CTC生物標(biāo)記模式分類與計數(shù)不僅能較準(zhǔn)確地診斷胰腺癌，還能提示腫瘤的轉(zhuǎn)移并評估患者的預(yù)后?；蜥槍υl(fā)灶中具有轉(zhuǎn)移傾向的細(xì)胞亞群尋找相應(yīng)的靶向藥物，從而對它們進行早期靶向治療，改善早中期腫瘤患者的預(yù)后。

2.4 研究腫瘤耐藥機制

每年死于腫瘤耐藥復(fù)發(fā)的患者不計其數(shù)，而多年的研究仍未徹底解決這個治療難題，通過對耐藥復(fù)發(fā)的實體瘤進行單細(xì)胞測序分析，我們可以更加深入地認(rèn)識腫瘤的耐藥機制。2014年，Lee等[20］分別對未經(jīng)化療、化療有效和對紫杉醇耐藥的轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，新發(fā)現(xiàn)耐藥的腫瘤細(xì)胞群存在38種與其他兩組不同的RNA變異，并闡述了化療有效的腫瘤細(xì)胞在紫杉醇誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄譜變化。2015年，Kim等[21］通過對34個異體種植的肺腺癌細(xì)胞進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)表達KRASG12D突變基因的腫瘤細(xì)胞亞群在體外實驗中對化療藥具有耐受性。2018年，Kim等[22］對多個三陰性乳腺癌患者的未經(jīng)化療和化療后的腫瘤組織進行單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組同步測序，分析表明耐藥基因是在化療后被優(yōu)勢選擇的已存在突變基因，但耐藥腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜是在化療后經(jīng)重編碼而獲得的。

這些通過單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)的新耐藥基因不僅解釋了部分腫瘤患者化療失敗和復(fù)發(fā)的原因，還預(yù)示著耐藥腫瘤進一步治療的潛在可能。此外，通過對化療中的腫瘤組織進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜分析，臨床上還可以初步評估患者對化療藥物的反應(yīng)。

2.5 描繪腫瘤免疫微環(huán)境

目前，許多研究都發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中含有大量的腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞，也證實了其中一些細(xì)胞在腫瘤發(fā)展中的作用。而隨著單細(xì)胞測序的應(yīng)用，我們對腫瘤免疫微環(huán)境有了更全面的了解。2017年，Chung等[23］對原位乳腺癌來源的175個腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)相關(guān)的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)，且T細(xì)胞多為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）和耗竭T細(xì)胞，而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞多為M2型。同年，Zheng等[24］通過對來自6例肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織、周圍正常組織和外周血的5 063個T細(xì)胞及T細(xì)胞受體進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)耗竭CD8+T細(xì)胞和Treg在腫瘤組織中占比最多，且lavilin基因在激活的T細(xì)胞和Treg中是上調(diào)的。2018年，Azizi等[25］分別對來源于8例乳腺癌患者原發(fā)腫瘤部位、正常乳腺組織、外周血和淋巴結(jié)的45 000個免疫細(xì)胞進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序及對比分析，不僅發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞存在多種不同的亞群和激活狀態(tài)，重建了腫瘤相關(guān)T細(xì)胞的進化軌跡，還發(fā)現(xiàn)部分Treg存在CTLA4、TIGHT和GITR基因共突變的現(xiàn)象。

單細(xì)胞測序可讓我們更全面地了解免疫細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，并有助于探索腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞中較為關(guān)鍵的突變基因和表面標(biāo)記，這些基因和分子標(biāo)記可能成為免疫治療的新目標(biāo)。同時，臨床上還能通過對腫瘤免疫微環(huán)境的分析來評估患者免疫治療的效果。

3 結(jié)語與展望

單細(xì)胞測序技術(shù)給實體瘤研究提供了新的角度，通過對數(shù)百個單細(xì)胞進行高通量測序，不僅可揭示實體瘤內(nèi)及其免疫微環(huán)境的細(xì)胞異質(zhì)性，還有助于我們對實體瘤進行更深入的研究，從而指導(dǎo)臨床上的早期診斷、靶向治療、療效監(jiān)測與預(yù)后評估。盡管現(xiàn)階段發(fā)展的單細(xì)胞測序技術(shù)仍存在一些問題，如耗時長，費用高，各種不可避免的技術(shù)誤差（有效細(xì)胞的破壞或丟失、覆蓋率低、測序結(jié)果偏倚、錯誤率較高、通量有限）[4，6，26］，樣本要求高等。隨著新技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞測序的時間將會加快，費用也將會降低，而測序的靈敏度和特異性將提高，對測序目標(biāo)的覆蓋率和準(zhǔn)確率也會趨近100%，且測序樣本不再局限于新鮮組織。2017年，Guillaumet-Adkins等[27］對超過1 000例新鮮和冷藏保存的單細(xì)胞進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序，表明保存過程并不改變轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，Martelotto等[28］還實現(xiàn)了對原位和侵襲性乳腺癌的石蠟包埋組織進行單細(xì)胞全基因組測序，描述了腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性及進化過程。完善后的單細(xì)胞測序技術(shù)不僅會成為實體瘤研究的主要手段，還將可能直接應(yīng)用于臨床，通過對腫瘤患者的組織標(biāo)本進行單細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組或表觀遺傳學(xué)測序分析，進而實現(xiàn)個體化的診治、監(jiān)測與評估。