血液標志物在局部晚期鼻咽癌中的預測價值

孫健達，熊 俊，張漢雄，陳意標

廣東省梅州市人民醫(yī)院放療科，廣東 梅州514031

鼻咽癌是一種獨特的頭頸部惡性腫瘤，發(fā)病具有明顯的地域性，在中國及東南亞地區(qū)高發(fā)，而其中又以中國的華南地區(qū)為甚。鼻咽癌是一種放射敏感及化療相對敏感的腫瘤，早期鼻咽癌的治療以根治性放療為主，局部晚期鼻咽癌以放化療綜合治療為主。以解剖結(jié)構(gòu)為基礎的TNM分期系統(tǒng)是目前治療決策及判斷預后的依據(jù)，但同一分期的患者接受相同的治療后往往會出現(xiàn)不同的預后，這就說明TNM分期系統(tǒng)仍然存在一定的缺陷。近年來隨著研究的不斷深入，血液生物標志物在腫瘤的預后判斷上取得顯著的進展。研究表明血小板計數(shù)、血小板與淋巴細胞比值（platelet to lymphocyte ratio，PLR）及EB病毒（Epstein-Barr virus，EBⅤ）DNA等標志物與鼻咽癌的預后顯著相關[1-3］，且與TNM分期結(jié)合后可改善原有分期對預后的預測價值[4-5］。目前尼妥珠單抗被推薦用于Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌患者的放療過程中，但是究竟哪一部分患者能夠從治療中獲益仍然沒有定論。本研究通過對接受尼妥珠單抗治療的局部晚期鼻咽癌患者治療前血小板計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、PLR及EBⅤ DNA拷貝數(shù)的檢測，探討其與分期之間的相關性，以及在近期療效的預測作用，以期指導對尼妥珠單抗治療的優(yōu)勢人群的篩選。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2015年5月—2018年10月梅州市人民醫(yī)院放療科收治的初治并經(jīng)病理學確診、無遠處轉(zhuǎn)移的局部晚期鼻咽癌患者共83例。納入標準：① Ⅲ～Ⅳa期（中國2008分期）；② 年齡為18～70歲；③ 初次治療；④ 無放化療禁忌證；⑤ 治療前有完整的血液學檢查結(jié)果；⑥ 無感染性疾病或血液系統(tǒng)疾病。所有患者的病理學分型均為未分化型非角化性癌，而且均接受尼妥珠單抗聯(lián)合放化療綜合治療。其中男性57例，女性26例；中位年齡46歲（范圍24～69歲）；T1-2期27例，T3-4期56例；N0-1期20例，N2-3期63例；Ⅲ期41例，Ⅳa期42例。治療前對患者病情的評估包括癥狀和體征、電子鼻咽鏡檢查、胸部及上腹部電子計算機斷層（computed tomography，CT）增強掃描、鼻咽部及頸部磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）增強掃描、發(fā)射型計算機斷層掃描（emission computed tomography，ECT）骨顯像，部分患者行全身正電子發(fā)射計算機斷層顯像（positron emission tomography/computed tomography，PET/CT）檢查。

1.2 血常規(guī)檢測方法

所有患者治療前采取清晨空腹外周血2 mL，采用SYSMEX XE-2100全自動血細胞分析儀對全血標本進行檢測，全程按照操作說明進行。記錄血小板計數(shù)及淋巴細胞計數(shù)。PLR定義為血小板計數(shù)絕對值除以淋巴細胞計數(shù)絕對值。根據(jù)血小板計數(shù)及淋巴細胞計數(shù)將患者分為兩組，A組為血小板計數(shù)及淋巴細胞計數(shù)均在正常范圍，B組為血小板計數(shù)或淋巴細胞計數(shù)任一升高。

1.3 EBV DNA拷貝數(shù)檢測方法

所有患者治療前采取清晨空腹靜脈血2 mL，之后向試管內(nèi)注入含乙二胺四乙酸二鈉（EDTA2Na）或枸櫞酸鈉試管立即輕輕顛倒試管混合5～10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，密閉送檢。取全血1 mL至干燥玻璃試管，加入0.9%NaCl溶液1 mL輕搖混勻；取干燥玻璃試管加入500 μL淋巴細胞分離液，將稀釋好的全血用移液器緩慢加入加有淋巴細胞分離液的試管中。2 000 r/min離心20 min，吸取白細胞層（從上往下的第二層），加入1.5 mL離心管，12 000 r/min離心5 min。離心后去上清液，沉淀中加入50 μL DNA提取液充分混勻，100 ℃恒溫溫育10 min。12 000 r/min離心5 min，備用。按比例（EBⅤPCR反應液40 μL/人份+Tap酶3 μL/人份）取相應量的PCR反應液及Tap酶，充分混勻后按43 μL管分裝至0.2 mL離心管中，備用。向準備好試劑的0.2 mL離心管分別加入處理后的樣品（標本、陰性質(zhì)控品、臨界或強陽性質(zhì)控品）上清液2 μL或陽性定量參考品2 μL，8 000 r/min離心數(shù)秒。EBⅤ試劑購自達安基因股份有限公司。在Roche LightCycler 480擴增儀上進行PCR 擴增，93 ℃預變性2 min，93 ℃變性5 s，57 ℃延伸45 s，共進行40個循環(huán)擴增，37 ℃ 1 s，反應結(jié)束后再通過軟件讀取數(shù)值。本院EBⅤ DNA拷貝數(shù)檢測的參考范圍是0～1 000 U/mL，因此EBⅤ DNA升高定義為拷貝數(shù)大于1 000 U/mL。

1.4 治療方法

56例患者接受調(diào)強適形放療，27例患者接受容積旋轉(zhuǎn)調(diào)強放療。鼻咽部照射劑量70～74 Gy/33次。有4例患者在放療結(jié)束時鼻咽病灶殘留明顯，其中1例予以三維適形局部推量6 Gy/3次 ，另外3例予以后裝放療（2例放療劑量為10 Gy，1例放療劑量為12 Gy）；有1例患者在放療過程中因機器故障而中斷放療的時間較長，因此在放療結(jié)束后按原計劃加放療1次。頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)照射劑量為66～74 Gy/33次，高危區(qū)PTⅤ1照射劑量為60～66 Gy/33次，低危區(qū)PTⅤ2照射劑量為50～54 Gy/28次。所有患者接受1～3個周期以鉑類藥物為基礎的聯(lián)合方案新輔助化療，以及1～3個周期鉑類藥物單藥同期化療。部分T4、N3或具有其他高危因素的患者放療結(jié)束后接受輔助化療，共20例，其中18例接受1～3個周期以鉑類藥物為基礎的聯(lián)合方案化療，另外2例患者因為體質(zhì)較弱而接受卡培他濱或替吉奧口服化療。放療過程中予以尼妥珠單抗治療，每次200 mg，每周1次。12例患者完成6次尼妥珠單抗治療，71例患者完成7次尼妥珠單抗治療。

1.5 療效評價

放療結(jié)束復查電子鼻咽鏡、鼻咽+頸部MRI增強掃描、胸部X線/CT、上腹部彩超/CT，以評價療效。近期療效評價采用實體瘤療效評價標準（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）1.1版[6］。其中，完全緩解（complete response，CR）為所有靶病灶消失，所有病變淋巴結(jié)的短徑均小于10 mm；部分緩解（partial response，PR）為靶病灶直徑之和比基線水平減少至少30%；疾病進展（progressive disease，PD）為靶病灶直徑之和相對增加至少20%（直徑之和的絕對值增加至少5 mm），或出現(xiàn)新的病灶；疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）為靶病灶直徑之和減少的程度沒有達到PR，增加的程度也沒有達到PD。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 治療前血液標志物與腫瘤分期的關系

83例患者中血小板計數(shù)為255.47±71.69（×109/L），PLR為150.82±68.65。EBⅤ DNA拷貝數(shù)≤1 000 U/mL的患者28例，EBⅤ DNA拷貝數(shù)＞1 000 U/mL的患者55例。所有淋巴細胞計數(shù)升高的患者，血小板計數(shù)均在正常范圍，共5例；所有血小板計數(shù)升高的患者，淋巴細胞計數(shù)均在正常范圍，共8例；血小板計數(shù)及淋巴細胞計數(shù)均在正常范圍內(nèi)的患者共70例。治療前血小板計數(shù)、PLR、EBⅤ DNA水平、聯(lián)合血小板計數(shù)和淋巴細胞計數(shù)均未顯示出與腫瘤的T分期、N分期及臨床分期之間存在明顯的相關性（表1～3）。

表 1 83例鼻咽癌患者治療前血小板計數(shù)及PLR值與腫瘤分期的關系Tab. 1 The association of pretreatment platelet count and PLR with tumor staging in 83 NPC patients

表 2 83例鼻咽癌患者治療前EBV DNA水平與腫瘤分期的關系Tab. 2 The relationship between pretreatment EBV DNA levels and tumor staging in 83 NPC patients[n (%)］

表 3 83例鼻咽癌患者治療前聯(lián)合血小板計數(shù)和淋巴細胞計數(shù)與腫瘤分期的關系Tab. 3 The association of pretreatment combination of platelet count and lymphocyte count with tumor staging in 83 NPC patients[n (%)］

2.2 治療前血液標志物與近期療效的關系

放療結(jié)束時，鼻咽病灶CR為58例，PR為23例，SD為2例；頸部淋巴結(jié)CR為64例，PR為16例。由于放療后鼻咽病灶SD只有2例，因此在探討治療前血液標志物與鼻咽病灶近期療效的關系時將這2例患者納入PR組中一并進行統(tǒng)計。治療后鼻咽病灶達到完全緩解的患者的血小板計數(shù)平均值低于未達到完全緩解的，差異接近有統(tǒng)計學意義（P=0.068）。治療前聯(lián)合血小板計數(shù)和淋巴細胞計數(shù)與治療后頸部淋巴結(jié)的緩解程度顯著相關，A組患者的頸部淋巴結(jié)完全緩解率高于B組（分別為85.1%和53.8%），差異有統(tǒng)計學意義。治療前PLR及血漿EBⅤ DNA水平與治療后腫瘤的緩解程度無顯著相關性（表4～6）。

表 4 治療前血小板計數(shù)及PLR值與治療后腫瘤緩解程度的關系Tab. 4 The association of pretreatment platelet count and PLR with tumor response after treatment

表 5 治療前EBV DNA水平與治療后腫瘤緩解程度的關系Tab. 5 The relationship between pretreatment EBV DNA levels and tumor response after treatment[n (%)］

表 6 治療前聯(lián)合血小板計數(shù)和淋巴細胞計數(shù)與治療后腫瘤緩解程度的關系Tab. 6 The association of pretreatment combination of platelet count and lymphocyte count with tumor response after treatment[n (%)］

3 討 論

隨著放療設備的更新，放療技術(shù)的改進、影像學診斷技術(shù)的進步以及新的、有效的化療藥物的應用，鼻咽癌患者的治療效果得到不斷的提高，早期患者的5年總生存率可達94.0%，而對于局部區(qū)域晚期患者而言，5年總生存率為54.0%～69.7%[7-8］。研究表明尼妥珠單抗聯(lián)合放化療可提高局部晚期鼻咽癌患者的療效，改善患者的預后[9］。但必須指出的是，并不是所有的患者均能從尼妥珠單抗的治療中獲益。因此通過研究鼻咽癌患者預后的相關因素能更準確地預測患者的預后，并能幫助臨床醫(yī)師做出正確的臨床決策。

血小板在止血及血栓形成過程中發(fā)揮著主要的作用，但越來越多的研究表明，血小板在介導腫瘤細胞的生長、擴散及血管生成的過程中也起著重要的作用。腫瘤細胞與血小板可通過直接相互作用及分泌生物活性蛋白，從而協(xié)助腫瘤擴散轉(zhuǎn)移，同時血小板與腫瘤細胞形成聚合體，保護腫瘤細胞免受宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[10］。因此血小板計數(shù)的增多與腫瘤患者較差的預后相關。PLR把反映腫瘤狀態(tài)的血小板與反映機體免疫能力的淋巴細胞結(jié)合起來，在腫瘤預后的預測中所發(fā)揮的作用也引起了廣泛的關注。Gao等[11］及Jiang等[12］分別報道治療前血小板計數(shù)及PLR與鼻咽癌患者的臨床分期及T分期顯著相關，而本研究的結(jié)果則顯示治療前血小板計數(shù)及PLR與腫瘤的T分期、N分期及臨床分期之間無顯著的相關性，這與Xie等[13］及Lu等[14］報道的結(jié)果相似。除此以外，Xie等[13］及Lu等[14］還分別報道了血小板計數(shù)及PLR的升高與較差的預后相關。而本研究的結(jié)果則顯示對于接受尼妥珠單抗治療的局部晚期鼻咽癌患者，治療前血小板計數(shù)及PLR與治療后腫瘤的緩解程度無顯著相關性。造成這種研究結(jié)果出現(xiàn)差異的原因可能與各個研究所采用的截點值及統(tǒng)計方法不同有關。在Gao等[11］及Xie等[13］的研究中血小板計數(shù)的截點值分別取300×109/L和266×109/L，而在Jiang等[12］及Lu等[14］的研究中PLR的截點值分別取108.33和174.00。Gao等[11］采用卡方檢驗來研究血小板計數(shù)與臨床特征的關系，而本研究則采用t檢驗來研究血小板計數(shù)與分期之間的關系。有研究發(fā)現(xiàn)，血小板計數(shù)跟中性粒細胞與淋巴細胞比值的評分較單一指標更能預測鼻咽癌患者的預后[15］，本研究也得出相似的結(jié)論。對于接受尼妥珠單抗治療的患者，治療前聯(lián)合血小板計數(shù)和淋巴細胞計數(shù)與治療后頸部淋巴結(jié)的緩解程度顯著相關，血小板計數(shù)及淋巴細胞計數(shù)均正常的患者的頸部淋巴結(jié)完全緩解率顯著升高。

EBV是一種重要的人類病原體，與未分化鼻咽癌密切相關[16］。研究表明，治療前血漿EBⅤDNA是EBⅤ相關鼻咽癌腫瘤負荷的標志物，腫瘤負荷越大，EBⅤ DNA拷貝數(shù)越高[17-18］，EBⅤDNA水平與T分期、N分期及臨床分期均顯著相關[2，5，19］。而在本研究中，治療前EBⅤ DNA水平與T分期、N分期及臨床分期均無顯著相關性。另外，研究表明治療前血漿EBⅤ DNA水平與鼻咽癌患者的預后密切相關，EBⅤ DNA水平升高是患者預后不良的標志[2，18-20］。但本研究結(jié)果則顯示治療前血漿EBⅤ DNA水平與治療后鼻咽病灶及頸部腫大淋巴結(jié)的緩解程度均無顯著相關性。目前各個實驗室的檢測設備、DNA提取、檢測的DNA片段、質(zhì)控、檢測極限值等均缺乏統(tǒng)一的標準[21］，這可能是造成本研究結(jié)果與文獻報道不一致的原因之一。

由于簡單、方便、費用不高及創(chuàng)傷小，且能在一定程度上反映腫瘤的異質(zhì)性，因此血液標志物對鼻咽癌的預后影響受到越來越多的重視。但目前各個研究中心的檢驗設備、試劑及方法等缺乏統(tǒng)一標準，導致研究結(jié)果的可比性較差，因此急需制定標準化的檢驗方法及流程。由于本研究是單中心回顧性研究，樣本量較小，且并未對患者的長期生存情況進行分析，因此所得出的結(jié)論具有一定的局限性。另外，在本研究中由于部分患者拒絕在治療后3個月MRI復查，因此采用治療結(jié)束復查的結(jié)果來評價療效，而目前多數(shù)文獻報道的是在治療結(jié)束后3個月或以上才進行療效的評價，這就造成本研究的完全緩解率較其他文獻[22-24］報道的低，從而在一定程度上影響了血液標志物對近期療效的預測作用。

綜上所述，尼妥珠單抗治療局部晚期鼻咽癌，治療前聯(lián)合血小板計數(shù)和淋巴細胞計數(shù)較單獨血小板計數(shù)、PLR和血漿EBⅤ DNA水平更能預測患者的近期療效。