釀造條件對蘋果白蘭地中異丁醇、異戊醇及苯乙醇含量的影響

曾朝珍，康三江，張霽紅，張芳，張海燕，袁晶

（甘肅省農業(yè)科學院農產品貯藏加工研究所，甘肅蘭州 730070）

蘋果產業(yè)是甘肅省的特色優(yōu)勢產業(yè)，也是主產區(qū)農民增收的支柱產業(yè)。近年來，隨著我國人口不斷增多，耕地面積減少，面臨糧食短缺的危機，需要大量進口。若能以水果代替部分糧食釀酒，不僅能夠消化利用蘋果資源，緩解供需矛盾，穩(wěn)定蘋果產業(yè)，同時也能滿足國人擅飲高度酒的嗜好，又符合我國酒業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略。蘋果白蘭地是蘋果經破碎榨汁、酒精發(fā)酵、蒸餾、橡木桶陳釀而成的新型水果類白酒[1]。高級醇是指在釀酒過程中由酵母分解蛋白質、氨基酸及糖類而產生的及具有強烈氣味的含有六個碳原子以上一元醇的高沸點混合物[2]。發(fā)酵酒的香氣特征和口感與高級醇的種類和含量有關，發(fā)酵酒中的高級醇主要有正丙醇、異丁醇、正丁醇、正戊醇、異戊醇、β-苯乙醇等[3,4]，但過高含量的高級醇會使人產生頭疼、惡心等癥狀，對人體健康造成危害[5]。蘋果白蘭地釀造過程中酵母酒精發(fā)酵會產生高級醇，發(fā)酵因素影響高級醇的含量，發(fā)酵工藝決定著高級醇含量的高低[6]，酵母的代謝途徑和次級代謝產物的生成量都會隨著發(fā)酵因素的改變而發(fā)生變化[7]。高級醇是蘋果白蘭地中重要的風味物質，其含量的高低對酒體的風味及品質有很大的影響，有必要研究不同發(fā)酵因素下高級醇含量的產生機制及變化規(guī)律，以期能夠有效控制蘋果白蘭地中高級醇的含量。目前，關于蘋果白蘭地釀造過程中發(fā)酵因素對高級醇影響的研究鮮有報道。前期的實驗研究發(fā)現(xiàn)異丁醇、異戊醇及苯乙醇是蘋果白蘭地中主要的高級醇，因此，本文以甘肅慶陽富士蘋果為原料，主要研究了蘋果白蘭地釀造過程中異丁醇、異戊醇及苯乙醇含量的變化，評價不同發(fā)酵因素對蘋果白蘭地酒中主要高級醇含量的影響，以期為蘋果白蘭地生產中高級醇的生成控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：釀酒酵母（CICC 31084、CICC 31085、CICC 32178、CICC 32130、CICC 32168），均由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供。

材料：富士蘋果（Malus pumilaMill）：采自甘肅慶陽市。

試劑：3-辛醇：色譜純，美國Sigma公司。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30 min，然后紗布過濾，再加糖及瓊脂，融化后補足水至 1000 mL，121 ℃滅菌30 min，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.2 儀器與設備

三重四級桿氣質聯(lián)用儀（GC型號：TRACE 1310，MS型號：ISQ-LT），美國賽默飛世爾科技公司；LRH-70型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；Breville-BJE500F型榨汁機，澳大利亞鉑富公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 菌種制備

將釀酒酵母保藏菌種轉接于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h。從保存的斜面培養(yǎng)基中用接種環(huán)挑去2～3環(huán)菌苔接種于裝有100 mL液體PDA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結束后用血球計數(shù)板計數(shù)確定不同釀酒酵母濃度，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 發(fā)酵條件對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響研究

1.3.3.1 釀酒酵母對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

將破碎榨汁后的蘋果汁分裝到500 mL的三角瓶中，裝液量為400 mL，在蘋果汁中分別接種釀酒酵母（CICC 31084、CICC 31085、CICC 32178、CICC 32130、CICC 32168），接種量為6%，接種濃度為1×104cfu/mL，在20 ℃進行恒溫發(fā)酵，發(fā)酵過程中當二氧化碳失重量不再變化時則發(fā)酵結束。發(fā)酵結束后蒸餾取樣，測定蘋果白蘭地中異丁醇、異戊醇及苯乙醇含量。

1.3.3.2 發(fā)酵溫度對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

相同工藝流程下在蘋果汁中接種釀酒酵母（CICC 32130），分別以20、25、30、35 ℃進行恒溫發(fā)酵，發(fā)酵結束后蒸餾取樣，測定蘋果白蘭地中異丁醇、異戊醇及苯乙醇含量。

1.3.3.3 酵母接種濃度對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

相同工藝流程下在接種濃度分別為1×104、1×105、1×106和1×107cfu/mL條件下20 ℃進行恒溫發(fā)酵，發(fā)酵結束后蒸餾取樣，測定蘋果白蘭地中異丁醇、異戊醇及苯乙醇含量。

1.3.4 可同化氮對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響研究

1.3.4.1 氨基酸添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

將破碎榨汁后的蘋果汁分裝到500 mL的三角瓶中，裝液量為400 mL，在蘋果汁中分別接種釀酒酵母（CICC 32130），接種量為 6%，接種濃度為 1×104cfu/mL，稱取不同質量的纈氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸添加到蘋果汁發(fā)酵液中，使得蘋果汁發(fā)酵液中氨基氮的添加達到0、50、100、150、200 mg N/L的濃度，在 20 ℃進行恒溫發(fā)酵，發(fā)酵過程中當二氧化碳失重量不再變化時則發(fā)酵結束。發(fā)酵結束后蒸餾取樣，測定蘋果白蘭地中異丁醇、異戊醇及苯乙醇含量。

1.3.4.2 銨態(tài)氮添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

相同發(fā)酵工藝條件下稱取不同質量的氯化銨、磷酸氫二銨添加到蘋果汁發(fā)酵液中，使得蘋果汁發(fā)酵液中銨態(tài)氮的添加達到0、100、200、300、400 mg N/L的濃度，20 ℃進行恒溫發(fā)酵，結束后蒸餾取樣測定蘋果白蘭地中異丁醇、異戊醇及苯乙醇含量。

1.3.5 碳源對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響研究

相同發(fā)酵工藝條件下稱取不同質量的蔗糖和葡萄糖添加到蘋果汁發(fā)酵液中，添加量分別為0%、2%、4%、8%、16%，20 ℃進行恒溫發(fā)酵，結束后蒸餾取樣測定蘋果白蘭地中異丁醇、異戊醇及苯乙醇含量。

1.3.6 分析方法

1.3.6.1 樣品預處理方法

將蘋果白蘭地酒樣稀釋5倍，分別取5 mL稀釋后樣品加入50 μL 3-辛醇內標，漩渦混勻，裝入15 mL頂空瓶中，樣品由TriPlus RSH Autosampler-SPME系統(tǒng)自動處理進樣，萃取頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭。萃取條件：60 ℃吸附40 min，保溫5 min。

1.3.6.2 樣品分析方法

GC條件：進樣口溫度25 ℃，載氣He，流速1.2 mL/min。進樣量1 μL，分流進樣，分流比40：1。色譜柱為DB-WAX (30 m×0.25 mm×0.25 μm)，升溫程序40 ℃恒溫2 min，以5 ℃/min的升溫速度升至180 ℃，然后以15 ℃/min的升溫速度升至230 ℃，保持5 min。MS條件：EI電離子源，電子能量70 eV，離子源溫度 200 ℃，接口溫度 250 ℃。掃描范圍 33.00～350.00 u。

1.3.6.3 二氧化碳失重量測定

采用失重法，二氧化碳失重量=發(fā)酵前稱重-發(fā)酵后稱重。

1.4 數(shù)據處理

本研究通過Excel 2003進行試驗數(shù)據匯總處理，采用DPS 7.05進行顯著性差異分析（p＜0.05）及origin 8.0軟件對實驗數(shù)據進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵條件對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響研究

2.1.1 酵母種類對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

不同釀酒酵母對蘋果白蘭地發(fā)酵中主要高級醇形成的影響結果如圖1所示。

圖1 酵母種類對蘋果白蘭地主要高級醇含量的影響Fig.1 Effect of yeast species on the content of higher alcohols in apple brandy

圖1方差分析結果表明，釀酒酵母（CICC 31084、CICC 31085、CICC 32178、CICC 32130、CICC 32168）發(fā)酵產生的主要高級醇含量差異顯著（p＜0.05），其中釀酒酵母（CICC 31085）發(fā)酵產生的異丁醇、異戊醇及苯乙醇含量最高且與其它釀酒酵母相比差異顯著（p＜0.05），分別達到了0.71 mg/L、5.56 mg/L和0.74 mg/L，而釀酒酵母（CICC 32130）發(fā)酵產生的異丁醇、異戊醇及苯乙醇含量最低分別為0.35 mg/L、4.46 mg/L和0.39 mg/L，比釀酒酵母（CICC 31085）發(fā)酵的含量低50.7%、19.8%和47.3%；另外，不同酵母菌發(fā)酵產生異丁醇、異戊醇及苯乙醇的能力不同，其中異戊醇的含量最高，與異丁醇和苯乙醇存在顯著差異性（p＜0.05）。試驗結果表明，不同發(fā)酵菌種對異丁醇、異戊醇及苯乙醇形成的影響是顯著的，不同酵母菌產生主要高級醇的能力有顯著差異性。其它一些研究也證實，發(fā)酵菌種對高級醇成分的影響較大[8-9]，高級醇中異戊醇的產量較高[10]。因此可以通過選擇適宜的酵母菌種來調控蘋果白蘭地中主要高級醇的含量[11]。

2.1.2 發(fā)酵溫度對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

不同發(fā)酵溫度對蘋果白蘭地發(fā)酵中主要高級醇形成的影響結果如圖2所示。

由圖2結果可以看出，除了發(fā)酵溫度25 ℃以外，其它發(fā)酵溫度產生的異丁醇、異戊醇及苯乙醇含量差異不顯著（p＞0.05）。隨著發(fā)酵溫度的升高，異丁醇、異戊醇及苯乙醇的含量也在增加，當發(fā)酵溫度為25 ℃時，酵母發(fā)酵產生的異丁醇、異戊醇及苯乙醇含量最高，分別達到了0.37 mg/L、4.79 mg/L和0.41 mg/L，與發(fā)酵溫度為20 ℃時的含量相比分別提高了32.1%、47.8%和95.2%；但是隨著發(fā)酵溫度的進一步升高，異丁醇、異戊醇及苯乙醇的含量并未隨溫度的升高而增加，相反其含量降低。經分析認為酵母的高級醇脫氫酶活力與其產高級醇的能力有關且呈正相關，酵母代謝過程中脫氫酶的活性因發(fā)酵溫度的影響而引起了高級醇總量顯著性變化。因此，降低發(fā)酵溫度可以減少高級醇的生成量[12]，而于濤等[13]的研究認為發(fā)酵溫度對高級醇生成的影響主要是通過抑制酵母的生長繁殖來實現(xiàn)。

圖2 發(fā)酵溫度對蘋果白蘭地主要高級醇含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the content of higher alcohols in apple brandy

2.1.3 酵母接種濃度對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

釀酒酵母接種濃度對蘋果白蘭地發(fā)酵中主要高級醇形成的影響結果如圖3所示。

圖3 酵母接種濃度對蘋果白蘭地主要高級醇含量的影響Fig.3 Effect of inoculum size on the content of higher alcohols in apple brandy

酵母接種濃度對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響如圖3所示，蘋果白蘭地中異丁醇、異戊醇及苯乙醇的含量都隨著酵母接種濃度的增大而增大且不同接種濃度處理差異顯著（p＜0.05）；在接種濃度為1×107cfu/mL時含量最大分別為0.31 mg/L、4.16 mg/L和0.34 mg/L,比接種濃度為1×104cfu/mL時的含量分別增加了19.2%、24.9%和25.9%。以上結果表明，酵母的接種濃度大使酵母繁殖量增大，發(fā)酵速度快，代謝生成的高級醇的含量增大。MATEO J J等[14]的研究也認為發(fā)酵中高級醇的含量會隨著酵母接種量的提高而增多，而甄會英等[15]的研究表明高級醇的生成量都會因酵母濃度過高或過低而增大。酵母菌添加量的變化對高級醇生成有抑制作用，異丁醇隨酵母添加量增大而不斷增加且增加幅度較大，而正丁醇和異戊醇的含量與酵母添加量呈負相關[16]，另外，也有研究認為大部分高級醇是在主發(fā)酵期間隨酵母繁殖而形成，主發(fā)酵結束后高級醇的含量幾乎不再發(fā)生變化[17～19]。因此，選擇適宜的酵母接種濃度是控制高級醇生成的有效方式。

2.2 氨基酸添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

2.2.1 纈氨酸添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

纈氨酸添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響結果如圖4所示。

圖4 纈氨酸對蘋果白蘭地主要高級醇含量的影響Fig.4 Effect of valine on the content of higher alcohols in apple brandy

由圖4可知，纈氨酸添加后異丁醇、異戊醇和苯乙醇含量均顯著高于對照（p＜0.05），其中纈氨酸添加后，異丁醇的含量顯著增加且與各濃度處理相比差異顯著（p＜0.05），當纈氨酸添加量為150 mg N/L時，異丁醇含量最高為5.02 mg/L，與未添加纈氨酸相比含量增加1573.3%，再隨著濃度升高至200 mg N/L時，異丁醇含量降低至4.86 mg/L且與150 mg N/L濃度處理相比差異顯著（p＜0.05）；異戊醇的含量變化趨勢與異丁醇相似，在添加量為150 mg N/L時，異戊醇含量最高為5.90 mg/L，但與異丁醇含量變化相比上升幅度較小，比未添加纈氨酸發(fā)酵的含量增加53.2%，再隨著濃度升高其含量降低至5.27 mg/L且與150 mg N/L濃度處理相比差異顯著（p＜0.05）；苯乙醇的含量也隨纈氨酸添加量的增加而增加，在添加量為200 mg N/L時含量最高為0.48 mg/L，比未添加纈氨酸發(fā)酵的含量增加45.5%，但與添加量為150 mg N/L時的含量相比，苯乙醇的含量維持在一個相對穩(wěn)定的水平且差異不顯著（p＞0.05）。圖5結果表明，纈氨酸的添加對異丁醇含量影響最為顯著，使異丁醇的含量顯著增加，異丁醇的形成與纈氨酸具有很強的相關性。有研究表明，纈氨酸的添加可導致異丁醇產量顯著增加[20]，同時高級醇的代謝途徑也表明纈氨酸的添加促進了異丁醇的分解代謝途徑，導致纈氨酸分解產生異丁醇而使其含量增大。

2.2.2 亮氨酸添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

亮氨酸添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響結果如圖5所示。

圖5 亮氨酸對蘋果白蘭地主要高級醇含量的影響Fig.5 Effect of leucine on the content of higher alcohols in apple brandy

圖5結果表明，亮氨酸添加后異丁醇、異戊醇和苯乙醇含量均與對照差異顯著（p＜0.05），其中，亮氨酸添加后異丁醇含量降低，與對照相比分別降低了13.7%、13%、15.7%和9.3%，但各濃度之間含量差異不顯著（p＞0.05）；在亮氨酸添加范圍內，異戊醇的含量隨著亮氨酸添加量的增加而顯著增加且各濃度處理差異顯著（p＜0.05），當亮氨酸的添加量為200 mg N/L時，異戊醇含量顯著增加達到44.04 mg/L，且與未添加亮氨酸相比含量增加1043.9%；苯乙醇的含量也隨著亮氨酸添加后發(fā)生變化，與對照相比分別增加了14.5%、20.6%、42.1%和 65.2%，且添加不同濃度亮氨酸后苯乙醇的含量與未添亮氨酸相比差異顯著（p＜0.05）；各添加濃度之間除了50 mg N/L與100 mg N/L之間苯乙醇含量差異不顯著外（p＞0.05），其它添加濃度之間苯乙醇含量差異顯著（p＜0.05）。由圖5結果可以看出，添加亮氨酸使異戊醇的含量逐漸增加，隨著添加量的繼續(xù)增加異戊醇含量變化顯著。有研究表明，異戊醇含量的增加是因亮氨酸添加而導致的[21]，因此，添加氮源時不宜大量添加一種氨基酸，以防相應的高級醇大量產生，同時此試驗結果也驗證了分解代謝途徑中特定氨基酸生成特定高級醇的理論。

2.2.3 苯丙氨酸添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

苯丙氨酸添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響結果如圖6所示。

圖6 苯丙氨酸對蘋果白蘭地主要高級醇含量的影響Fig.6 Effect of phenylalanine on the content of higher alcohols in apple brandy

由圖6可知，苯丙氨酸添加后使得苯乙醇的含量在各濃度及對照之間差異顯著（p＜0.05），苯乙醇的含量隨苯丙氨酸添加量的增加呈顯著性增長，當苯丙氨酸的添加量為200 mg N/L時，苯乙醇含量達到了38.53 mg/L，且與對照相比顯著增加了11575.8%；異丁醇的含量除了苯丙氨酸添加量為50 mg N/L時比對照降低了0.7%以外，其它各添加濃度下異丁醇含量均比對照增加1%、12.3%和10.7%，但各濃度之間其含量與對照相比均無顯著差異性（p＞0.05）；異戊醇的含量與對照相比含量降低且差異顯著（p＜0.05）。單獨添加苯乙醇合成的前體氨基酸苯丙氨酸時，仍能顯著提高酒中苯乙醇的含量，說明苯乙醇的含量與苯丙氨酸的添加量呈正相關[22]。同時由高級醇的代謝途徑可知，隨著苯丙氨酸的加入，苯丙氨酸促進了苯乙醇的分解代謝途徑，促進了苯乙醇的生成。

2.3 銨態(tài)氮添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

氯化銨、磷酸氫二銨添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響結果如圖7～8所示。

從圖7～8可以看出，隨著銨態(tài)氮添加量逐漸增加，幾種銨態(tài)氮對主要高級醇含量的影響變化趨勢幾乎一致，異丁醇、異戊醇及苯乙醇的含量隨著銨態(tài)氮含量的增加而降低且各濃度及對照之間差異顯著（p＜0.05）。異丁醇與異戊醇在氯化銨添加濃度為300 mg N/L時降低比例最大，分別為39.3%和30.6%，但都與氯化銨添加濃度為200 mg N/L時的含量相比均無顯著差異性（p＞0.05）；而苯乙醇在氯化銨添加濃度為400 mg N/L時降低比例最大為19.4%，但與氯化銨添加濃度為200、300 mg N/L時的含量相比均無顯著差異性（p＞0.05）； 磷酸氫二銨的添加濃度最大時異丁醇、異戊醇及苯乙醇的含量降低比例最大，分別與對照相比降低42.7%、44.7%和28.2%，與其它各添加濃度下異丁醇、異戊醇及苯乙醇的含量相比，除了異戊醇在磷酸氫二銨添加濃度為400 mg N/L時的含量與其它濃度下其含量相比差異顯著（p＜0.05）以外，異丁醇與苯乙醇在此添加濃度下的含量與其它濃度下其含量相比均無顯著差異性（p＞0.05）。本研究結果表明，向蘋果汁中添加適量銨態(tài)氮可有效減少高級醇的生成，究其原因是由于蘋果汁中酵母可同化氮源不足，游離氨基酸缺乏，酵母在生長繁殖過程中不能把α-酮酸全部氨化生成氨基酸從而導致酮酸積累[21]，剩余的酮酸在酶作用下經脫羧-還原等一系列生化作用生成高級醇[23]，最終導致蘋果白蘭地釀造中高級醇合成途徑明顯多于降解代謝途徑。因此，添加適量銨態(tài)氮可有效地減少高級醇的生成并促進酵母發(fā)酵，避免發(fā)酵停滯現(xiàn)象的發(fā)生。

圖7 氯化銨對蘋果白蘭地主要高級醇含量的影響Fig.7 Effect of ammonium chloride on the content of higher alcohols in apple brandy

圖8 磷酸氫二銨對蘋果白蘭地主要高級醇含量的影響Fig.8 Effect of ammonium dihydrogen phosphate on the content of higher alcohols in apple brandy

2.4 碳源添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響

蔗糖和葡萄糖添加對蘋果白蘭地主要高級醇形成的影響結果如圖9～10所示。

圖9 蔗糖對蘋果白蘭地主要高級醇含量的影響Fig.9 Effect of sucrose on the content of higher alcohols in apple brandy

圖10 葡萄糖對蘋果白蘭地主要高級醇含量的影響Fig.10 Effect of glucose on the content of higher alcohols in apple brandy

圖9～10結果表明，隨著糖含量的增大，異丁醇、異戊醇及苯乙醇的生成量整體呈增大的趨勢。碳源的添加濃度最大時異丁醇、異戊醇及苯乙醇的含量增加的比例最大，添加16%的蔗糖使異丁醇、異戊醇及苯乙醇的含量增加了73%、60.2%和136.7%，而添加16%的葡萄糖使異丁醇、異戊醇及苯乙醇的含量增加了93%、84.5%和91.8%。在蘋果白蘭地發(fā)酵過程中，為提高發(fā)酵酒精度而向蘋果汁中添加碳源。然而，單純提高蘋果汁的糖度不僅會對酵母的正常代謝產生影響，還會因其它營養(yǎng)物質的相對缺乏導致酵母異常發(fā)酵。通過對本研究結果分析認為可能是因為單方面增加糖度導致其它營養(yǎng)物，如氮源相對不足，從而阻礙了生成氨基酸等正常代謝途徑的完成，進一步刺激了高級醇的合成代謝[6]，最終導致蘋果白蘭地酒中高級醇含量的增加。

3 結論

3.1 蘋果白蘭地釀造工藝條件影響高級醇的含量并決定著高級醇含量的高低。采用適宜的釀酒酵母菌種、控制酵母接種濃度及降低發(fā)酵溫度都可以有效控制蘋果白蘭地發(fā)酵中異丁醇、異戊醇及苯乙醇的產生。

3.2 蘋果白蘭地發(fā)酵中添加適宜的銨態(tài)氮有利于降低異丁醇、異戊醇及苯乙醇的含量，但是對于可同化有機氮則不宜大量添加一種氨基酸，以防相應的高級醇大量產生。

3.3 蘋果白蘭地發(fā)酵中為提高酒精度而過多添加碳源不僅會阻礙酵母的正常代謝，而且也會導致蘋果白蘭地酒中高級醇含量的增加。