糖耗速率對濃香型白酒發(fā)酵過程異戊醇合成的影響

梁清文，方芳*

1(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 食品合成生物技術教育部工程研究中心，江蘇 無錫，214122) 4(江南大學 江蘇省食品合成生物技術工程研究中心，江蘇 無錫，214122)

異戊醇是微生物在發(fā)酵過程中代謝產生的高級醇重要組分。異戊醇對白酒的風味有一定的貢獻作用，但其濃度過高可能會使酒體呈現(xiàn)異味且可能產生一定的毒性效應[1-2]。在保證白酒風味的同時提高白酒的飲用舒適感需要將白酒中的異戊醇含量控制在適當范圍(<35 mg/100 mL)[3]。

白酒發(fā)酵體系是多菌種參與的開放發(fā)酵體系，異戊醇的合成不僅與酵母菌的氨基酸代謝有關，也受多種環(huán)境因素影響，依此異戊醇的減控策略主要分為微生物手段、調整合成前體含量和優(yōu)化發(fā)酵條件3種。Saccharomycescerevisiae、Pichiakudriavzevii、Kazachstania是異戊醇合成的主要貢獻菌[3-5]，其中S.cerevisiae是減控異戊醇的主要研究對象。選育低合成異戊醇的酵母菌是減控單一菌種發(fā)酵酒類中異戊醇的有效手段，使用基因工程[6-9]、誘變選育[10-12]、天然優(yōu)良菌株的分離純化[13]等選育方法獲得的酵母菌在對應模擬發(fā)酵體系可減控20%～60%異戊醇。但基因工程菌目前不能用于食品發(fā)酵，而其他選育獲得的菌株在混菌發(fā)酵體系中減控效果尚未獲得驗證。選育高效合成異戊酯的菌株對減少固態(tài)發(fā)酵白酒異戊醇也有一定效果，如采用高產酯低產高級醇酵母作為主發(fā)酵菌可使清香型白酒的異戊醇質量濃度從779.6 mg/L降至643.1 mg/L[14]，在起始時接種Wickerhamomycesanomalus也能使?jié)庀阈桶拙飘愇齑假|量濃度從127.7 mg/L降至70.2 mg/L[15]。減少酵母增殖量被證實為是有效的減控手段，如添加活性干酵母可使醬香型白酒中異戊醇高級醇含量降低24.6%[16]。增加氮源或碳氮源供給也能達到異戊醇的減控作用，如提高α-氨態(tài)氮含量可使高粱汁發(fā)酵體系中高級醇含量降低31.8%[17]，添加快速氮源也使黃酒發(fā)酵體系中異戊醇合成量降低23.03%～27.9%[18-19]；提高用曲量或添加酶制劑能使液態(tài)法發(fā)酵的大曲酒異戊醇含量降低52.2%[20]，但是此策略具有不穩(wěn)定性，有時會導致異戊醇含量升高[21]。此外，也有研究通過調整發(fā)酵工藝來控制固態(tài)白酒發(fā)酵體系中的異戊醇含量，如使用高溫發(fā)酵可將酒醅的異戊醇含量降低44.6%[22]、提高酒醅孔隙度可將清香型白酒里異戊醇相對含量降低25%[23]。綜上可知，雖然可通過多種方法來減控異戊醇，但是一些方法的適用性仍待驗證。因此，深入研究調控策略的內在調控機制，對解析白酒發(fā)酵過程的異戊醇合成機制及研究異戊醇的精準調控具有重要意義。

本研究將通過考察濃香型白酒發(fā)酵過程中主要產異戊醇酵母菌種類、初始濃度、發(fā)酵條件和大曲糖化酶活力對異戊醇合成的影響，揭示與異戊醇合成相關的發(fā)酵指標或參數(shù)，以期減少濃香型白酒中異戊醇的合成量，為降低白酒發(fā)酵過程的異戊醇提供減控策略。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品采集

本研究中的樣品均由江蘇某酒廠提供。大曲為同一車間的樣品，適當粉碎后混合室溫保存；酒醅為濃香型白酒發(fā)酵用酒醅，取樣后置于-80 ℃保存。

1.1.2 菌株

酵母菌株SaccharomycescerevisiaeJP3、PichiafermentansJP22、PichiakudriavzeviiJP1為本課題組保藏菌株，分離自濃香型白酒發(fā)酵酒醅[3]；NaumovozymacastelliJP7W-W、TorulasporadelbrueckiiJP2d-2、KazachstaniahumilisJP5d-30為本研究獲得，分離自濃香型白酒發(fā)酵酒醅；NaumovozymadairenensisCBS421為標準菌株，生物風網站。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母提取物10。

孟加拉紅培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，KH2PO41，MgSO2·7H2O 0.5，瓊脂20，0.3%(體積分數(shù))孟加拉紅溶液100 mL，氯霉素0.1，瓊脂20。

1.1.4 主要試劑及儀器

異戊醇、叔戊醇，Sigma公司；福林酚試劑，麥克林公司；DNS試劑、蝸牛酶，索萊寶生物科技有限公司；2×TaqPlus Master Mix，康為世紀生物科技有限公司；瓊脂糖及其他試劑均為色譜純或分析純，上海生工生物工程公司；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅公司；GC-2010AF氣相色譜儀、UV1240紫外可見分光光度計，日本島津公司；Waters 2695高效液相色譜儀，美國沃特世公司；PCR儀、Aminex HPX-87H有機酸分析柱，美國Bio-Rad公司；恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)GelD，美國 Bio-Rad公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母種類及初始濃度對異戊醇合成的影響

稱取250 g入池酒醅于500 mL廣口瓶中，分別與用生理鹽水洗滌并重懸的S.cerevisiaeJP3(5×105，5×106，5×107CFU/g)、P.fermentansJP22(1×106，5×106，1×107CFU/g)、P.kudriavzeviiJP1(1×106，5×106，1×107CFU/g)菌液混合，密封后發(fā)酵置于30 ℃下發(fā)酵。對照組為不添加酵母菌。

1.2.2 發(fā)酵條件對異戊醇合成的影響

發(fā)酵起始溫度根據(jù)實際生產時的發(fā)酵條件進行梯度設置和升溫過程模擬，分別以18、22、26、30 ℃作為發(fā)酵起始溫度，在0～2 d溫度保持不變， 3～7 d每天升溫2 ℃直至達到30 ℃后保持恒溫發(fā)酵，其中起始發(fā)酵溫度為18 ℃時，在第6～7天共升溫4 ℃。

考察裝料量對異戊醇合成的影響時，使用密封性良好的50 mL離心管為發(fā)酵容器，分別裝填20 g(松散裝料)，25 g(正常裝料)，30 g(較緊實裝料)以及35 g(緊實裝料)。蓋緊蓋子后置于30 ℃下發(fā)酵。

1.2.3 大曲糖化酶活力對異戊醇合成的影響

以不同糖化酶活力的大曲為考察對象，探究還原糖供應對異戊醇合成的影響。將3種大曲分別與酒醅充分混合后，取250 g裝于500 mL廣口瓶中，密封后置于30 ℃恒溫發(fā)酵。

1.3 分析測定

1.3.1 酒醅中酵母數(shù)量的測定

準確稱取5.0 g酒醅，置于裝有95 mL生理鹽水的搖瓶(含玻璃珠)中。置于搖床中，30 ℃、220 r/min振蕩30 min，取上清液進行梯度稀釋，涂布于孟加拉紅平板30 ℃培養(yǎng)1～2 d。畢赤酵母數(shù)量分析采用孟加拉紅平板計數(shù)法(圖1-b中的大菌落)。釀酒酵母數(shù)量通過對圖1-b中的非畢赤酵母菌落進行PCR驗證后計數(shù)。擴增所用的特異性引物為SC2F(GGCCAGGTTCTTGTAGCCAA)、SC2R(GCTTCCCTGAGA-TCGCTTCT)。具體操作為：挑菌落至含10 μL ddH2O的PCR管中，加入5 μL 50 U/μL蝸牛酶混勻，37 ℃水浴10 min再置于-80 ℃中放置30 min。取上層液體作為PCR的模板DNA。PCR擴增體系：12.5 μL 2×TaqPlus Master Mix，上下游引物各1 μL，模板DNA 3 μL以及ddH2O 7.5 μL。PCR條件：94 ℃變性5 min，其次是30個循環(huán)包括在94 ℃ 30 s、63 ℃ 15 s和72 ℃ 15 s，最后在72 ℃延伸5 min。對產物進行凝膠電泳檢測，將PCR產物為235 bp的菌落記錄為釀酒酵母。

a-釀酒酵母特異性引物驗證(M-Marker,SC-S.cerevisiae，KH-K.humilis，NC-N.castelli，ND-N.dairenensis，TD-T.delbrueckii，PF-P.fermentans，PK-P.kudriavzevii,下同)；b-涂布孟加拉紅的畢赤酵母計數(shù)方法(大菌落為Pichia)；c-菌落PCR法分析圖b中的S.cerevisiae數(shù)量(C-S.cerevisiae對照，+-S.cerevisiae, --non-S.cerevisiae)圖1 酒醅中畢赤酵母和釀酒酵母的定量分析Fig.1 Quantitative analysis of Pichia and S.cerevisiae in fermented grain

1.3.2 大曲酶活力的測定

糖酶活力測定參考QB/T 4259—2011《釀酒大曲通用分析方法》，蛋白酶活力測定參考SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》。

1.3.3 還原糖的測定及表觀耗糖速率的估算

固態(tài)樣品預處理：準確稱取10 g發(fā)酵酒醅，加入20 mL超純水，冰浴超聲30 min，4 ℃下10 000 r/min離心5 min，取上清液用于檢測分析[24]。采用DNS法檢測還原糖含量[25]，預估表觀耗糖速率的計算如公式(1)所示：

式中：m0,拌曲酒醅中初始還原糖含量，g/kg；m1,考察時間范圍對應的最高還原糖含量，g/kg；m2,考察時間范圍對應的最低還原糖含量，g/kg；t,發(fā)酵時間，d。

1.3.4 酒醅乙醇含量的測定

樣品提取液采用高效液相色譜法檢測乙醇含量[26]。色譜柱為Aminex HPX-87H有機酸分析柱 (300 mm×7.8 mm)，色譜條件：流動相0.05 mol/L H2SO4；流速0.5 mL/min；進樣量10 μL；柱溫40 ℃；示差檢測器45 ℃。

1.3.5 異戊醇的測定

待測樣品中加入終質量濃度為6 mg/L的叔戊醇，采用頂空-氣相色譜-氫離子火焰檢測器檢測異戊醇含量[27]。色譜柱為DB-Wax(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm)，平衡溫度70 ℃，平衡時間35 min。進樣口溫度200 ℃，檢測器溫度260 ℃，分流比3∶1。升溫程序：初始溫度40 ℃，保持5 min，然后以10 ℃/min的速度升至180 ℃保持5 min。載氣N2，流速9 mL/min。

2 結果與分析

2.1 酵母種類及其初始菌濃對異戊醇合成的影響

S.cerevisiae和Pichia是濃香型白酒發(fā)酵過程合成異戊醇的主要酵母菌[3]，它們在增殖過程主要通過Harris途徑合成異戊醇[28-29]。Harris途徑以糖的利用為起始，為探究白酒發(fā)酵過程酒醅中S.cerevisiae和Pichia的增殖、糖的消耗與異戊醇合成的關系，本研究首先考察了酒醅中酵母種類與起始濃度對還原糖消耗和異戊醇合成的影響。由圖2-c可知，實驗條件下異戊醇的合成時期為1～7 d。

由圖2-a可知，發(fā)酵起始酒醅中Pichia的種類和菌濃度對S.cerevisiae在異戊醇合成時期的增殖幾乎沒有影響，而發(fā)酵起始酒醅中S.cerevisiae的種類和菌濃度對Pichia在異戊醇合成時期的增殖也沒有影響。在異戊醇合成時期，Pichia的增殖倍數(shù)為0～2.5，而S.cerevisiae的增殖倍數(shù)為1.3～5.3。Pichia增殖倍數(shù)的改變沒有降低異戊醇的合成水平，而S.cerevisiae的增殖倍數(shù)從5.3降低至1.3(發(fā)酵起始酒醅中S.cerevisiae數(shù)量為5×107CFU/g)時異戊醇合成量降低了22.9%，在異戊醇合成時期之后酒醅中的含量降低41.0%(圖2-c)。由圖2-b可知S.cerevisiae增殖倍數(shù)最低的實驗組酒醅中前3 d的預估表觀耗糖速率最低，為13.9 g/(kg·d)，比對照低42.3%。其他實驗組發(fā)酵前3 d預估表觀耗糖速率為21.2～26.6 g/(kg·d)，與對照[24.2 g/(kg·d)]較接近，對異戊醇無減控效果或減控效果不明顯。同時，不同酵母種類及初始菌濃度的添加條件下7 d的乙醇含量均在5.1～5.8 mL/100 g，乙醇含量變化不明顯(數(shù)據(jù)未展示)，除添加1×106CFU/g和1×107CFU/gPichiakudriavzevii會導致乙醇含量下降1.4%～2.5%以外，其余添加情況可提高乙醇含量0.8%～12%。

這些結果說明，S.cerevisiae的增殖倍數(shù)、預估表觀耗糖速率和異戊醇合成水平之間存在一定的相關性；發(fā)酵起始S.cerevisiae的數(shù)量可影響白酒發(fā)酵過程酒醅中預估表觀耗糖速率和異戊醇水平，即降低S.cerevisiae增殖倍數(shù)、減慢預估表觀耗糖速率可使異戊醇合成水平降低。

a-酵母增殖數(shù)量；b-還原糖消耗量；c-異戊醇合成量圖2 酵母菌種類和初始菌濃對白酒發(fā)酵過程異戊醇合成的影響Fig.2 Effect of yeast species and its initial concentration on iso-amyl alcohol synthesis during Baijiu fermentation

2.2 發(fā)酵條件對異戊醇合成的影響

2.2.1 發(fā)酵起始溫度對異戊醇合成的影響

酒醅溫度是監(jiān)測發(fā)酵進程的重要指標，在白酒窖內發(fā)酵過程中呈先升高，而后維持高溫，最后緩慢降溫的變化規(guī)律[22,30]。溫度可通過改變微生物的代謝強度和酒醅中酶系的水解速度共同影響異戊醇的合成。為探究溫度對異戊醇合成的影響機制，考察了發(fā)酵起始溫度對酒醅中的S.cerevisiae增殖和糖耗速率以及異戊醇合成的影響。由圖3-a可知，不同發(fā)酵起始溫度對Pichia在異戊醇合成時期的增殖倍數(shù)沒有影響，而采用低于20 ℃的發(fā)酵起始溫度可使S.cerevisiae增殖速度減慢，增殖倍數(shù)降低。Pichia的增殖倍數(shù)為1.0～1.2，S.cerevisiae增殖倍數(shù)為1.5～2.1。S.cerevisiae增殖倍數(shù)從2.1降低至1.5(18 ℃起始發(fā)酵)，發(fā)酵至2 d時預估表觀耗糖速率為8.7 g/(kg·d)，比26 ℃起始發(fā)酵的降低59.4%(圖3-b)，發(fā)酵7 d時異戊醇降低22.6%(圖3-c)。而22、30 ℃起始發(fā)酵S.cerevisiae增殖倍數(shù)雖然無明顯變化，但其2 d預估表觀耗糖速率分別為10.9和15.1 g/(kg·d)，異戊醇也降低了16.5%和17.7%(圖3-c)。30 ℃起始發(fā)酵的預估表觀耗糖速率比22 ℃的高，但是異戊醇減控效率較低，其原因可能是30 ℃發(fā)酵時其他不產異戊醇的微生物代謝也比較活躍，消耗了較多還原糖。起始發(fā)酵溫度對乙醇合成量有較大影響，相較于異戊醇合成量最高的26 ℃起始發(fā)酵的酒醅，其他3個溫度起始發(fā)酵7 d的酒醅中乙醇含量提高了23.7%～36.1%，含量在6.0～6.6 mL/100 g(數(shù)據(jù)未展示)。

這些結果表明使用較低的入池溫度可減控異戊醇，其原因在于低溫起始發(fā)酵可降低釀酒酵母的增殖數(shù)量和降低其預估表觀耗糖速率進而減少異戊醇的合成。與本研究相似是，SUN等[31]的研究也表明溫度對高級醇合成的影響在于低溫降低了酵母對還原糖的利用。

a-酵母增殖數(shù)量；b-還原糖消耗量；c-異戊醇合成量圖3 發(fā)酵起始溫度對白酒發(fā)酵過程異戊醇合成的影響Fig.3 Effect of initial fermentation temperature on iso-amyl alcohol synthesis during Baijiu fermentation注：*表示P<0.05；**表示P<0.01(下同)

2.2.2 裝料量對異戊醇合成的影響

濃香型白酒的入池發(fā)酵是先有氧后厭氧的過程[32]。初始氧氣含量提高會加快酵母的增殖和代謝活動，從而導致異戊醇含量提高。而白酒的固態(tài)發(fā)酵工藝中常通過添加稻殼來保持物料蓬松，這也提高了體系中的含氧量。但有研究報道少量提高稻殼量反而能降低異戊醇[19]，因此為了平衡添加稻殼帶來的疏松作用和體系中的含氧量，本文在不改變酒醅稻殼量的條件下，探究了壓緊程度對異戊醇合成的影響。由圖4-a可知，不同的裝料量對異戊醇合成時期的Pichia和S.cerevisiae增殖無影響，此時期Pichia增殖倍數(shù)為3.5～3.8，S.cerevisiae增殖倍數(shù)為4.6～4.7，無明顯差別。而且4種條件下5 d預估表觀耗糖速率均在4.4～4.7 g/(kg·d)，無明顯差別(圖4-b)。由圖4-c可知，在相同稻殼含量的酒醅中，壓緊程度對異戊醇合成無明顯影響，發(fā)酵7 d時含量為12.4～13.1 mg/kg。這也進一步驗證了先前研究的結果，發(fā)酵過程S.cerevisiae大量增殖和還原糖的快速消耗是合成大量異戊醇的前提，而在4種裝料量下S.cerevisiae的增殖規(guī)律和增殖倍數(shù)相同、預估表觀耗糖速率都較低且沒有明顯差別，因此沒有減少異戊醇合成的效果。而且4種裝料量條件下發(fā)酵7 d酒醅中乙醇含量為2.2～2.3 mL/100 g，相較于正常裝料量，其他條件的裝料量乙醇含量提高了3.7%～5.9%，含量無明顯差別(數(shù)據(jù)未展示)。

a-酵母增殖數(shù)量；b-還原糖消耗量；c-異戊醇合成量圖4 裝料量對白酒發(fā)酵過程異戊醇合成的影響Fig.4 Effect of loading amount on iso-amyl alcohol synthesist during Baijiu fermentation

2.3 大曲糖化酶活力對異戊醇合成的影響

濃香型白酒發(fā)酵過程的還原糖主要來源于大曲糖化酶水解淀粉原料，初始糖化酶活力會影響糖化速率和還原糖的供應[33]。為探究還原糖的供應對異戊醇合成的影響，考察了大曲糖化酶活力對酵母增殖、預估表觀耗糖速率以及異戊醇合成影響。使用糖化酶活力差異顯著的大曲對異戊醇合成時期的Pichia和S.cerevisiae生長趨勢無明顯影響，在此時期Pichia增殖倍數(shù)為1.7～2.1，S.cerevisiae增殖倍數(shù)為2.2～2.3，表明大曲糖化酶活力對酵母增殖無明顯影響(圖5-a、圖5-c)。分析酒醅中還原糖消耗可以知大曲1、大曲2、大曲3的發(fā)酵2 d內預估表觀耗糖速率分別為25.7、16.8、15.4 g/(kg·d)，即大曲糖化酶活力與酒醅中預估表觀耗糖速率是正相關關系，其中大曲2、大曲3中的預估表觀耗糖速率分別比大曲1降低34.8%、40.3%(圖5-d)。由圖5-b可知，酶活力差異明顯的大曲對異戊醇合成有顯著影響。使用酶活力較低的大曲2和大曲3可減控異戊醇10.3%～13.3%。這表明可通過調整大曲糖化酶活力來達到異戊醇減控的目的。同時，使用不同的大曲對酒醅乙醇含量無明顯影響，其含量在4.8～5.1 mL/100 g。相較于糖化酶活力最高的大曲1，使用大曲2、大曲3發(fā)酵的酒醅中乙醇含量分別提高了6.2%和0.6%，無明顯差別(數(shù)據(jù)未展示)。

以上結果表明，在一定范圍內大曲的糖化酶活力不影響酵母的增殖，但是低糖化酶活力可減慢還原糖的供應，降低酵母利用還原糖的速率來減少異戊醇的合成。

a-大曲糖化酶活力；b-異戊醇合成量；c-酵母增殖數(shù)量；d-還原糖消耗量圖5 大曲糖化酶活力對異戊醇合成的影響Fig.5 Glucoamylase activity of Daqu and its effect on iso-amyl alcohol synthesist during Baijiu fermentation

3 結論與討論

探究濃香型白酒發(fā)酵過程酵母菌種類、發(fā)酵條件以及大曲對異戊醇合成的影響是研究白酒窖內發(fā)酵異戊醇合成機制的一部分，可為減控白酒發(fā)酵過程的異戊醇提供理論支持。本研究發(fā)現(xiàn)改變初始的酵母菌數(shù)量與種類、發(fā)酵初始溫度和大曲糖化酶活力，可降低酵母菌的增殖數(shù)量和預估表觀耗糖速率，進而降低發(fā)酵過程中的異戊醇合成量。通過提高初始的酵母菌濃度確定了降低異戊醇合成時期的S.cerevisae增殖倍數(shù)(5.3降低至1.3)和預估表觀耗糖速率(降低了42.3%)可減控異戊醇22.9%。同樣地，采用較低的發(fā)酵起始溫度和使用低糖化酶活力的大曲可降低異戊醇合成時期預估表觀耗糖速率，減少了異戊醇的合成量。

本研究中所用的酒醅和大曲原料來自不同批次的樣品，酵母初始含量和大曲酶活力的不同，造成批次間異戊醇含量差異較大。這也反映了在白酒發(fā)酵過程中，需根據(jù)實際情況采取對應的調控策略——通過檢測大曲、酒醅中S.cerevisiae的數(shù)量以及大曲糖化酶活力，來決定是否添加酵母進行數(shù)量調整，或將不同庫存時間的大曲混合來調整酶活力。通過減少S.cerevisiae增殖倍數(shù)與降低預估表觀耗糖速率的方法，可實現(xiàn)對濃香型白酒發(fā)酵過程的異戊醇減控，并為建立濃香型白酒發(fā)酵過程異戊醇調控機制以及其他香型白酒的異戊醇調控的研究提供參考。