白酒釀造中適產高級醇釀酒酵母菌株選育研究進展

李園子,田伏錦,王鳳寰,廖永紅

(北京工商大學 輕工科學技術學院，北京，100048)

白酒作為我國傳統(tǒng)的蒸餾酒，歷史悠久，其作為一種嗜好性飲品，白酒的品質及對健康的影響一直受到廣泛關注。風味是影響白酒品質的重要屬性之一[1]，高級醇作為重要的呈香呈味物質，其含量的多少影響著白酒的品質。從1906年至今，高級醇的研究已經歷了110多年的發(fā)展。高級醇是含3個及以上碳鏈骨架的一價醇類的總稱[2]，主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、2-甲基丁醇、2-苯乙醇等[3]。不同酒中高級醇的種類和含量各不相同，每種高級醇都具有其獨特的呈味特征(表1)，共同作用形成各式風味獨特的白酒。適量且適宜比例的高級醇可以賦予酒體豐富的口感，但當高級醇超過一定限度，酒體會呈現(xiàn)苦澀、沖辣的現(xiàn)象，產生不愉悅的雜味[4]。

表1 主要高級醇的呈味特征Table 1 Flavor characteristics of main higher alcohols

此外，研究發(fā)現(xiàn)，高級醇在人體內過多、較長時間的停留會導致人的神經系統(tǒng)受到損傷，不利于飲用者的身體健康[5]，因此，合理控制白酒中高級醇的含量顯得尤為重要。目前國標對白酒中高級醇的含量并沒有統(tǒng)一的規(guī)定，小曲液態(tài)發(fā)酵白酒中高級醇的含量一般為600～2 500 mg/L，固態(tài)發(fā)酵白酒中高級醇的含量一般為500～1 800 mg/L[6]。在白酒釀造過程中，釀酒酵母通過繁殖代謝生成相應的高級醇，隨著發(fā)酵時間的延長，高級醇可與酸類物質反應生成酯類物質，進一步改善白酒口感，提高酒體的品質。但與此同時，傳統(tǒng)白酒發(fā)酵工藝存在發(fā)酵周期長、酒損大、效率低、成本高等問題，不利于白酒的工業(yè)化生產。因此，為縮短發(fā)酵周期、降低工業(yè)能耗、減少生產成本、提高產品質量、探明釀酒酵母中高級醇的形成機制、合理調控白酒中高級醇的含量具有十分重要的意義。本文對釀酒酵母中高級醇的形成機制、關鍵調控基因和白酒釀造中適產高級醇釀酒酵母菌株的選育方式進行了歸納闡述，以期為合理控制白酒中高級醇含量，進一步為推動白酒行業(yè)的健康發(fā)展提供參考。

1 釀酒酵母中高級醇的生成途徑

在白酒釀造過程的主發(fā)酵時期，釀酒酵母發(fā)酵產生的中間代謝產物α-酮酸可經過脫羧、脫氫生成高級醇。根據(jù)α-酮酸來源的不同，高級醇的生成途徑可分為氨基酸分解代謝途徑和糖合成代謝途徑。

1.1 氨基酸分解代謝途徑

釀酒酵母在生長繁殖過程中，利用發(fā)酵原料中游離的氨基酸合成自身所需蛋白質，當氨基酸中的氨基被利用后，殘余的α-酮酸會通過脫羧、還原過程生成相應的高級醇[7]。1907年，德國化學家Felix Ehrlich首次提出了該代謝途徑，因此也被稱作Ehrlich途徑[2, 8]。特定的氨基酸會經過分解代謝途徑生成相應的高級醇，如纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸可在此途徑下經代謝分別生成異丁醇、異戊醇、2-苯乙醇、活性戊醇。

圖1 氨基酸分解代謝途徑Fig.1 The amino acids catabolic pathways

1.2 糖合成代謝途徑

葡萄糖可通過釀酒酵母的糖酵解途徑生成丙酮酸，丙酮酸進一步生成相應的α-酮酸，也可由三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)途徑直接生成相應的α-酮酸，α-酮酸會在相應酶的參與下，脫羧、還原生成相應的高級醇，即為糖合成代謝途徑[9]。同時，α-酮酸也可通過轉氨作用生成相應的氨基酸，若該過程中氨基供應不足，過量的α-酮酸會進一步生成相應的高級醇。該途徑最初由Harris提出，因此也被稱作Harris途徑。

圖2 糖合成代謝途徑Fig.2 The carbohydrates biosynthetic pathways

在白酒發(fā)酵早期，發(fā)酵液中氮源充足，釀酒酵母通過氨基酸分解代謝途徑生成的高級醇明顯增加。隨著發(fā)酵的進行，環(huán)境中游離氨基酸的含量逐漸減少，此時，釀酒酵母會利用糖合成代謝途徑生成自身所需氨基酸；若環(huán)境中氮源不足，釀酒酵母形成的α-酮酸則無法順利合成氨基酸，導致大量α-酮酸積累，此時，糖合成代謝途徑會被激活[10]，致使過量的α-酮酸經脫羧、還原生成相應的高級醇。在白酒生產過程中，正丙醇、異戊醇、異丁醇和活性戊醇等主要在糖代謝生成氨基酸的過程中產生，2-苯乙醇、酪醇、色醇等高級醇則主要來自氨基酸分解代謝途徑中相應氨基酸的降解代謝。研究發(fā)現(xiàn)，高級醇中異戊醇、異丁醇和活性戊醇的含量有75%來自糖代謝合成途徑，25%來自亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸參與的氨基酸分解代謝途徑[11]。

2 釀酒酵母中高級醇代謝調控關鍵基因

利用釀酒酵母生產飲料酒的方式已有八千多年的歷史[12]，同時高級醇的研究也經歷了百余年的發(fā)展，人們對釀酒酵母中高級醇代謝調控機制的研究正不斷深入。高級醇的形成受多種基因調控，各基因獨立且相互聯(lián)系，共同調控高級醇的生成(圖3)?，F(xiàn)對高級醇代謝調控關鍵基因的研究多集中在氨基酸代謝相關基因、α-酮酸合成相關基因、α-酮酸分解相關基因及乙酸酯代謝相關基因中。

2.1 氨基酸代謝相關基因

氨基酸是影響高級醇生成的重要因素，其中，氨基酸滲透酶和轉氨酶對釀酒酵母氨基酸的代謝至關重要，相關基因的表達水平影響著釀酒酵母對氨基酸的代謝能力。

在釀酒酵母中已發(fā)現(xiàn)16種氨基酸滲透酶[13]，根據(jù)釀酒酵母自身繁殖代謝的需要，氨基酸滲透酶可將底物輸送到細胞中，參與相關的代謝過程，其中，BAP2(編碼支鏈氨基酸滲透酶)和GAP1(編碼氨基酸轉運蛋白)基因的研究更為深入。BAP2基因編碼的支鏈氨基酸滲透酶參與亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸3種支鏈氨基酸的轉運，其表達水平影響著釀酒酵母對這3種氨基酸的攝取量。有研究表明，BAP2基因的缺失會導致亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的攝取量減少20%～50%[14]。同時，BAP2基因表現(xiàn)出一定的溫度依賴性，2001年，KODAMA等[15]研究了釀酒酵母BH-225中BAP2基因對高級醇生成量的影響，發(fā)現(xiàn)升高溫度可促進BAP2基因的表達，進而提高纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的吸收率。另外，環(huán)境中可利用氨基酸含量的變化誘導BAP2基因的轉錄，研究發(fā)現(xiàn)，微摩爾量的亮氨酸是調控發(fā)酵環(huán)境中支鏈氨基酸吸收的主要信號[16]。通過控制BAP2基因的表達以及環(huán)境中溫度和可利用氨基酸的含量，可實現(xiàn)對釀酒酵母氨基酸利用率的調控，進而影響高級醇的生成量。另外，GAP1基因編碼的氨基酸轉運蛋白Gap1可快速激活培養(yǎng)基誘導的發(fā)酵生長(fermentable-growth-medium-induced，F(xiàn)GM)信號通路，控制蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)靶點，研究發(fā)現(xiàn)，Gap1可將原料中常見的L型和D型氨基酸轉運到酵母細胞中，進而提供釀酒酵母生長代謝所需的氨基酸[17]。釀酒酵母對氨基酸的利用能力影響著高級醇的最終生成量，同時，氨基酸的積累也會影響釀酒酵母中氨基酸的分解代謝途徑，最終影響高級醇的形成[18]，而當發(fā)酵環(huán)境中缺乏氨基酸時，釀酒酵母將利用糖代謝產生的酮酸合成自身所需氨基酸，同時影響乙醇、高級醇、酯和其他風味物質的生成[19]。

圖3 釀酒酵母中高級醇的代謝途徑Fig.3 The higher alcohols metabolic pathway in Saccharomyces cerevisiaeBAP2-支鏈氨基酸滲透酶編碼基因；BAT1、BAT2-支鏈氨基酸轉氨酶編碼基因；LEU1-異丙基蘋果酸合成酶編碼基因；LEU2-β-丙基蘋果酸脫氫酶編碼基因；ILV1-蘇氨酸脫氨酶編碼基因；ILV2-乙酰乳酸合成酶編碼基因；ILV3-二羥酸脫水酶編碼基因；ILV5-乙酰羥基酸還原異構酶和mtDNA結合蛋白編碼基因；ILV6-乙酰乳酸合成酶調節(jié)亞基編碼基因；PDCs、THI3、ARO10-脫羧酶編碼基因；ADHs-乙醇脫氫酶編碼基因；SFA1-雙功能醇脫氫酶和甲醛脫氫酶編碼基因；ALDs-醛脫氫酶編碼基因；ATF1、ATF2-乙醇乙?；D移酶編碼基因。藍色箭頭代表糖合成代謝途徑，紅色箭頭代表氨基酸分解代謝途徑。

轉氨酶是Ehrlich途徑中的第一步反應酶，BAT1、BAT2、ARO8和ARO9基因的表達水平影響著氨基酸脫去氨基生成α-酮酸的過程。BAT1和BAT2基因編碼的支鏈氨基酸轉氨酶Bat1p和Bat2p分別位于線粒體和細胞質中，催化支鏈氨基酸和α-酮酸之間氨基的轉移[20]。2002年，YOSHIMOTO等[21]通過對BAT2基因研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，BAT2基因缺失突變體KY1058發(fā)酵后所生成的異戊醇和異丁醇的含量分別減少了40%和72%。ARO8和ARO9基因編碼的芳香族氨基酸轉氨酶促進芳香族氨基酸的利用，ARO8基因編碼的芳香族轉氨酶I負責苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成，其表達水平影響釀酒酵母中苯丙氨酸和酪氨酸的形成[22]，ARO9基因編碼的芳香族轉氨酶II主要參與色氨酸的降解。相關研究發(fā)現(xiàn)，過量表達ARO8或敲除ARO8基因，2-苯乙醇的產量均有所提升[23]，這可能是由于ARO8基因主要參與苯丙氨酸的脫氨反應[24]，過量表達可提高2-苯乙醇的合成水平，另外，由于各基因間的相互協(xié)調作用，使得敲除ARO8基因后誘導了ARO9基因的表達[22]，進而提高了2-苯乙醇的合成量。有研究證實，敲除釀酒酵母單倍體菌株的ARO8基因，可有效提高酵母菌株2-苯乙醇合成水平，在此基礎上過量表達ARO10(編碼脫羧酶)基因，2-苯乙醇的生成量可提高約13倍[25]。BAT1和BAT2基因的敲除阻礙了釀酒酵母對支鏈氨基酸中氨基的利用，導致高級醇生成量顯著降低；ARO8和ARO9基因可協(xié)同作用來調控釀酒酵母中2-苯乙醇的合成量。

2.2 α-酮酸合成相關基因

α-酮酸是釀酒酵母合成高級醇的關鍵中間代謝產物，LEUs和ILVs基因的表達水平影響著α-酮酸的合成過程。LEUs基因主要參與亮氨酸的合成[26]，ILVs基因主要參與纈氨酸及異亮氨酸的合成[27]，通過調控α-酮酸合成代謝途徑的關鍵基因及調控因子的表達，可有效控制高級醇的生成量。2011年，佐一含等[28]敲除釀酒酵母S-6中的LEU2(編碼β-丙基蘋果酸脫氫酶)基因后，將改造菌株與出發(fā)菌株一同進行發(fā)酵實驗來測定高級醇的生成量，結果發(fā)現(xiàn)，與出發(fā)菌株相比，改造菌株發(fā)酵液中高級醇的總含量降低了9.97%，發(fā)酵性能并無明顯變化。2013年，AVALOS等[29]同時過量表達釀酒酵母JAy1中的ILV2(編碼乙酰乳酸合成酶)、ILV5(編碼乙酰羥基酸還原異構酶)、ILV3(編碼二羥酸脫水酶)基因，結果顯示，與初始菌株相比，高級醇生成量提高了約2.3倍，其中異丁醇生成量提高3.8倍，提升幅度最大。LEUs和ILVs基因的表達水平皆可顯著影響釀酒酵母高級醇的合成能力，從而有效實現(xiàn)高級醇的合理化調控。

2.3 α-酮酸分解相關基因

α-酮酸在脫羧酶的作用下，脫羧形成醛類物質并產生CO2，形成的醛類物質可在醇脫氫酶的作用下進一步還原生成相應的高級醇。與該過程相關的脫羧酶編碼基因主要有PDC1、PDC5、PDC6、ARO10，YDL080c等，催化α-酮酸的脫羧過程，ADHs、SFA1基因編碼的醇脫氫酶進一步促進高級醇的生成。醛類物質也可以在ALDs基因編碼的醛脫氫酶的作用下脫氫生成相應的酸(圖3)。2012年，KONDO等[30]構建了ADH6(編碼NADPH依賴性中鏈醇脫氫酶)過表達菌株YTD16，與出發(fā)菌株相比，該菌株的異丁醇提高了2.6倍，為進一步改變乙醇向異丁醇生物合成的碳通量方向，實驗者在PDC1(編碼丙酮酸脫羧酶)基因缺失菌株的基礎上，構建ADH6、ILV2基因過表達菌株YTD306，與YTD106相比，YTD306的異丁醇產量高出1.8倍，且乙醇生成量明顯降低。2020年，ZHENG等[31]以釀酒酵母HJ-1為出發(fā)菌株構建了ALD6(編碼醛脫氫酶)過表達菌株，結果表明，改造菌株的高級醇生成量下降39%以上。上述研究發(fā)現(xiàn)，改變α-酮酸分解相關基因的表達水平可調控高級醇的代謝通路，相關數(shù)據(jù)可為釀酒酵母菌株的高級醇合理化調控提供理論參考。

2.4 乙酸酯代謝相關基因

高級醇一般在白酒釀造過程中的3～7天內形成，隨著發(fā)酵的進行，其絕大部分仍以高級醇的形式存在，而少部分會和乙酰輔酶A反應生成相應的乙酸酯類化合物，進一步改善白酒的品質。ATF1、ATF2、Lg-ATF1基因負責編碼的相應乙醇乙?；D移酶(Atf1p、Atf2p、Lg-Atf1p)可促進上述催化反應的進行。在發(fā)酵過程中，Atf1p和Atf2p參與乙酸乙酯和乙酸異酰胺的生成[32]，為研究ATF1和ATF2基因對高級醇及酯類物質含量的影響，2003年，VERSTREPEN等[33]對釀酒酵母BY4742進行ATF1和ATF2基因的敲除，發(fā)現(xiàn)ATF1基因的缺失使得菌株的乙酸乙酯生成量降低37.5%，乙酸異戊酯的生成量減少83.9%，但高級醇生成總量并無明顯變化；敲除ATF2基因后，乙酸乙酯生成量和乙酸異戊酯生成量分別減少12.5%、17.5%，高級醇總量無顯著變化。與其他乙醇乙?；D移酶相比，Atf1p活性最強，其對高級醇及乙酸酯的生成量影響最大[34]，同時，ATF1、ATF2等基因的表達對乙酸酯生成量的影響更為顯著，對高級醇生成量的影響存在不確定性。此外，IAH1基因編碼的乙酸異戊酯水解酯酶可通過水解酯類物質進而生成相應的醇[35-36]。

3 白酒釀造中適產高級醇釀酒酵母菌株的選育

在釀造過程中，原料和發(fā)酵工藝的改良是調控酒中高級醇含量的一種快捷、簡便的方法，但由于原料的差異性及發(fā)酵環(huán)境的復雜性，使得簡單通過改善工藝來控制高級醇的含量變得更加困難。白酒發(fā)酵液中的高級醇主要由釀酒酵母代謝生成[37]，通過調控釀酒酵母中高級醇的代謝途徑，選育優(yōu)良的釀酒酵母，可為高級醇的有效控制提供參考方向。目前，在白酒釀造中，選育適產高級醇釀酒酵母菌株的方式主要有誘變育種和基因工程育種。

3.1 誘變育種

誘變育種是通過物理、化學等因素對實驗菌株進行誘變，篩選、鑒定并最終選育出符合預期的優(yōu)良菌株的方法，其中高通量篩選是誘變育種選育優(yōu)良菌株的關鍵。常見的釀酒酵母誘變育種方法有紫外誘變、微波誘變、室溫常壓等離子體等，目前已有學者通過誘變的方式實現(xiàn)了白酒酵母高級醇合成的有效調控。

在誘變育種中，離子注入誘變是一種新型的復合誘變方法，具有生理損傷小、突變頻率高而廣的特點。2008年，王鵬銀等[38]通過低能氮離子注入誘變法獲得一株具有亮氨酸營養(yǎng)缺陷特性的釀酒酵母AY-15突變株，利用玉米糖化醪進行模擬液態(tài)白酒發(fā)酵實驗，并測定發(fā)酵液中高級醇的最終生成量，結果表明，與親本菌株相比，該突變株的異戊醇生成量降低39.85%，高級醇總含量降低33.6%，且發(fā)酵性能無明顯變化。室溫常壓等離子體誘變具有突變率高、處理溫度較低等優(yōu)點，非常適合釀酒酵母菌株的誘變。2015年，王國正等[39]對從酒曲中篩選得到的酵母菌株CF4進行常溫常壓等離子體誘變，篩選得到一株低產高級醇的釀酒酵母菌株ARTP5，通過模擬發(fā)酵測定高級醇生成量，結果表明，與親本菌株CF4相比，誘變菌株的高級醇產量降低20.0%。誘變育種可以在短時間內提高菌株突變率，進而篩選獲得適產高級醇的釀酒酵母。

3.2 基因工程育種

利用基因工程育種的方法對釀酒酵母合成高級醇的關鍵基因進行定向改造，可有效實現(xiàn)高級醇含量的調控。

3.2.1 氨基酸代謝相關基因的調控

為探究氨基酸代謝相關基因的表達對白酒高級醇生成量的影響，2013年，張翠英等[40]利用低產高級醇釀酒酵母工程菌株AYΔbat2進行小曲半固態(tài)白酒發(fā)酵實驗。結果發(fā)現(xiàn)，與純小曲發(fā)酵相比，工程菌株發(fā)酵得到的正丙醇、異丁醇和異戊醇含量分別降低20.6%、32.3%、50.8%，高級醇總量下降37.2%，BAT2基因的敲除可顯著降低半固態(tài)白酒發(fā)酵中釀酒酵母高級醇的生成量。2017年，LI等[41]以α5為出發(fā)菌株構建BAT2缺失菌株，通過模擬白酒發(fā)酵進一步測定高級醇合成量，研究發(fā)現(xiàn)，與α5相比，BAT2缺失菌株的高級醇總量降低了22.01%。2020年，WANG等[42]為探究GDH1(編碼谷氨酸脫氫酶)、CAN1(編碼精氨酸滲透酶)、GAT1(編碼氮分解抑制機制的轉錄調節(jié)蛋白)基因的敲除對白酒高級醇含量的影響，以釀酒酵母α5為出發(fā)菌株，進行模擬白酒發(fā)酵實驗，通過對比出發(fā)菌株及改造菌株的高級醇變化，發(fā)現(xiàn)α5Δgdh1菌株的高級醇含量為348.68 mg/L，降低了27.31%，α5Δcan1和α5Δgat1菌株的高級醇含量則分別提高211.44%和28.36%，實驗結果表明，氨基酸代謝對釀酒酵母高級醇的生成具有重要意義。

3.2.2 α-酮酸代謝相關基因的調控

在白酒高級醇的含量調控中，α-酮酸代謝相關基因起著重要作用。為研究LEU1(編碼異丙基蘋果酸合成酶)基因對白酒釀造過程中高級醇含量的影響，2015年，石鈺等[43]以釀酒酵母AY15單倍體A8為出發(fā)菌株，利用醋酸鋰轉化法和同源重組技術得到LEU1基因缺失突變株A-L9，隨后對出發(fā)菌株及突變菌株分別進行模擬酒精發(fā)酵和玉米糖化醪(添加30 mg/L亮氨酸)發(fā)酵實驗，測定最終高級醇的生成量，結果發(fā)現(xiàn)，與出發(fā)菌株相比，2種發(fā)酵條件下A-L9的正丙醇生成量分別提高18%、47%，異丁醇的生成量分別提高52%、158%，異戊醇的生成量則分別降低29%、51%，2種發(fā)酵方式均可在提高正丙醇、異丁醇的同時，降低異戊醇生成量，且突變株A-L9發(fā)酵性能無明顯變化。2018年，LI等[44]以釀酒酵母AY15 CICC 32315為出發(fā)菌株進行了ILV1、LEU1、LEU2基因的敲除，并通過白酒模擬發(fā)酵實驗對各菌株的高級醇最終生成量進行對比，與親本二倍體菌株相比，ILV1雙等位基因缺失菌株生成的正丙醇、活性戊醇和2-苯乙醇的濃度分別下降了30.33%、35.58%、11.71%，異丁醇和異戊醇產量分別升高326.39%、57.6%；LEU1雙等位基因缺失菌株的正丙醇和異丁醇合成量分別升高14.09%、41.72%，異戊醇和2-苯乙醇生成量分別下降33.74%、13.21%；LEU2雙等位基因缺失突變體的異丁醇合成量提高52.18%。α-酮酸在高級醇的代謝過程中至關重要，對α-酮酸代謝相關基因的合理調控，可在改變高級醇形成比例的同時，合理調控高級醇的最終生成量。此外，通過調控α-酮酸在線粒體和細胞質中的含量，可在不顯著改變高級醇總量的同時，實現(xiàn)各類高級醇合成量的差異化調控，對酒體風味的改善具有積極的指導作用[45]，同時，這些研究也為闡明釀酒酵母中α-酮酸的代謝機制提供了理論依據(jù)。

3.2.3 乙酸酯代謝相關基因的調控

乙醇乙?；D移酶催化乙酸酯類化合物的合成，影響高級醇和乙酸酯的最終生成量。2017年，LI等[46]在白酒發(fā)酵實驗中發(fā)現(xiàn)，以釀酒酵母α5為出發(fā)菌株，ATF1基因過表達、BAT2基因敲除菌株生成的乙酸乙酯含量是α5的54.03倍，與此同時，與α5相比，該改造菌株的高級醇含量降低了57.02%。此外，2017年，LI等[41]以BAT2敲除突變體為出發(fā)菌株進行ATF1、ATF2、Lg-ATF1基因過表達的研究，結果顯示，ATF2過表達菌株產生的高級醇與出發(fā)菌株相似，Lg-ATF1過表達菌株所產生的高級醇及酯類物質含量與出發(fā)菌株無明顯差異，而ATF1過表達菌株的高級醇合成量則降低48.17%，ATF1基因的表達水平對高級醇及乙酸酯生成量的影響更為顯著，而Lg-ATF1基因的影響程度最小。2018年，CUI等[47]為調節(jié)白酒中高級醇及酯的濃度，通過易錯PCR構建PGK1啟動子庫，以BAT2敲除釀酒酵母a45為出發(fā)菌株，利用7個不同的PGK1突變啟動子進行ATF1的過表達，結果表明所有構建菌株的酯及高級醇含量均明顯改變，其中乙酸乙酯的含量提高了1.66～27.22倍，異丁醇含量降低16.11%～30.97%，異戊醇含量降低1.78%～45.95%，2-甲基丁醇含量降低17.2%～42.94%，正丙醇和2-苯乙醇濃度無明顯變化。ATF1基因的過表達增加了乙酰輔酶A活性，促進了乙酸酯的生成[48]，同時BAT2基因的敲除可顯著降低高級醇含量[49]，進而有效調控白酒中的醇酯比。2019年，LI等[19]成功構建了BAT2敲除且ATF1過表達的工程菌株，該菌株可有效降低白酒發(fā)酵后高級醇的生成量，提高酯類物質的合成水平，進而更貼合工業(yè)生產的需求。此外，由于代謝途徑中涉及多個基因的相互作用及制約，因此高級醇關鍵基因的調控存在一定的復雜性及不確定性。2010年，郝欣等[50]在探究THI3基因缺失對白酒釀酒酵母AY-15的a型和α型單倍體菌株中高級醇生成水平的影響時，發(fā)現(xiàn)其最終高級醇的合成能力均未發(fā)生明顯改變。

表2 不同類型基因對釀酒酵母菌株高級醇的影響Table 2 Effects of different types of genes on higher alcohols in S.cerevisiae

4 總結和展望

白酒中的高級醇主要由釀酒酵母生成，利用誘變育種和基因工程育種的方式調控釀酒酵母中高級醇的代謝途徑，選育適產高級醇的釀酒酵母菌株對改善白酒的酒體和風味具有重要意義。目前，研究者們已利用誘變育種篩選出了大量適產高級醇的優(yōu)質釀酒酵母。但同時誘變育種也存在突變方向難控制、正向突變率低等問題，因此，提高誘變育種效率、探索定向誘變育種技術以及將誘變育種技術與其他生物技術相結合篩選適產高級醇釀酒酵母是未來研究的重要方向。利用基因工程育種可實現(xiàn)釀酒酵母中高級醇的定向調控，研究者們通過基因工程育種技術對高級醇代謝關鍵基因進行深入研究已經取得了顯著的成果，如對BAT2、ILVs、LEUs、ATF1等基因的定向改造，在保證釀酒酵母發(fā)酵性能不發(fā)生明顯變化的同時，實現(xiàn)了高級醇含量的有效控制。同時，無痕改造技術使通過基因工程育種獲得的工程菌株中不包含任何外源DNA片段，降低了安全隱患，相信未來基因工程菌株將逐步應用于白酒的工業(yè)化生產中。預測未來高級醇代謝相關基因的定向改造首先是更精細、全面地研究各基因對高級醇代謝的影響；其次是深度挖掘高級醇代謝網絡中各基因之間的互作關系，再者是在選育適產高級醇釀酒酵母菌株的同時，需充分考慮白酒整體的風味和口感，保證各風味物質之間的協(xié)調，這才能進一步為推動白酒行業(yè)的健康發(fā)展提供參考。