褐藻膠裂解酶AlgL17酶解工藝優(yōu)化及酶解產物分析

梁梅芳，吳利洋，倪 輝,2,3,4，姜澤東,2,3,4，肖安風,2,3,4，朱艷冰,2,3,4

(1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.廈門市食品與生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021； 4.廈門市南方海洋研究中心經濟海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建 廈門 361021)

0 引言

褐藻膠是一種線性多糖，由不同順序的β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古羅糖醛酸(G)通過共價(1-4)-鍵連接[1]，它是褐藻酸親水衍生物的統(tǒng)稱，在墨角藻、海帶、馬尾藻和巨藻等褐藻的細胞壁中大量存在。

褐藻寡糖(alginate oligosaccharides)是褐藻膠的裂解產物，它具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗菌[4]和促進植物生長[5]等生理活性，在農業(yè)、醫(yī)藥和食品等多個領域都有應用[6]。酶解法、化學法及物理法是現在主要的降解褐藻膠的方法[7]。與化學法、物理法相比，酶解法有更高的寡糖得率，有利于定向制備，并且反應條件相對溫和，不會對褐寡糖的還原末端造成傷害。有研究表明[8]，酶解法產生的褐藻寡糖比其他種類寡糖有更好的生物活性。

褐藻膠裂解酶(alginate lyase)通過消除糖苷鍵而降解海藻酸鈉[9-10]，是一種重要的海藻工具酶。褐藻膠裂解酶的酶學性質與其來源有關，不同來源的褐藻膠裂解酶的酶學性質存在較大差異[11]，現今研究的熱點是微生物來源的褐藻膠裂解酶，如來源于假交替單胞菌Pseudoaltermonaselyakovii、固氮菌Azotobactervinelandii以及棒桿菌Corynebacteriumsp.ALY-1的褐藻膠裂解酶。

在先前的研究中，本課題組篩選到一株褐藻膠裂解酶高產菌Microbulbifersp.ALW1[12]。本文將菌株ALW1的褐藻膠裂解酶基因AlgL17(GenBank收錄號KY780301)在大腸桿菌中大量誘導表達，從反應溫度、pH值、底物濃度、加酶量及振蕩速率等方面著手，以單因素試驗探討重組褐藻膠裂解酶AlgL17降解海藻酸鈉的條件，探索適合降解的相關工藝參數，以期為酶法降解褐藻膠研究積累實踐資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株 褐藻膠裂解酶AlgL17大腸桿菌基因工程菌，由本實驗室構建與保藏。

1.1.2 主要儀器與設備 HH-4/HH-8水浴鍋數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；冷凍離心機，BECKMAN COUNTER；JO92-ⅡN超聲波細胞粉碎機，寧波新藝超聲設備有限公司；Epoch2T微量酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；ACQUITY HPLC/MALDI SYNAPT Q-TOF MS，美國Waters Corp。

1.1.3 主要試劑 海藻酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司，化學純；其他試劑均為分析純產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 褐藻膠裂解酶粗酶的制備 將實驗室保存的重組褐藻膠裂解酶AlgL17大腸桿菌基因工程菌按1.2%的接種量接種到加有250 μL卡那霉素(50 g/L)的250 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至A600為0.6～0.8，加入25 μL異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)(0.5 mol/L)進行發(fā)酵培養(yǎng)，在18 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)20 h。將發(fā)酵的菌液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集菌體沉淀，用10 mL 50 mmol/L 的NaH2PO4-Na2HPO4(pH=8.0)緩沖液重懸菌體，冰浴條件下對重懸的菌體進行超聲破碎，接著在4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.2.2 還原糖的測定 利用3，5-二硝基水楊酸法(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)[13]測定還原糖含量，標準曲線利用葡萄糖繪制。

1.2.3 總糖含量的測定 利用苯酚-硫酸法[14]測定體系中的總糖含量。

1.2.4 平均聚合度的測定 酶解反應體系中的平均聚合度(average degree of polymerization，DP)按照以下公式計算：平均聚合度=總糖含量/還原糖含量 ，其值取整數[15]。

1.2.5 褐藻膠裂解酶的活力測定 取490 μL質量體積比為0.5%海藻酸鈉底物溶液(利用pH= 8.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配制)，向其中加入10 μL粗酶液，35 ℃反應30 min后，沸水浴5 min終止反應，加入500 μL DNS試劑，沸水浴10 min，迅速冷卻后，在540 nm下測定吸光度值。根據還原糖的生成量計算酶活力。褐藻膠裂解酶的酶活力單位定義為：在上述條件下，每分鐘降解底物產生1 μmoL還原糖( 以葡萄糖計)所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.2.6 單因素試驗 取4.9 mL質量分數0.5%海藻酸鈉底物溶液，向其中加入0.1 mL粗酶液，混勻后分別置于25，30，35，40，45，50 ℃下水浴210 min，每隔30 min取出0.5 mL，沸水浴5 min，然后加入0.5 mL DNS試劑，沸水浴10 min，取0.1 mL反應液稀釋至1 mL，在540 nm下測定吸光度值。以滅活的酶液作為對照組，與樣品組在同等條件下反應。保持其他因素不變，按上述方法逐一改變底物質量濃度、底物溶液pH值、酶用量和振蕩速率進行單因素試驗，每個因素最優(yōu)結果用于下一個單因素試驗。

1.2.7 酶解動力學 分別取4.9 mL質量分數 0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%，1.1%的海藻酸鈉底物溶液,向其中加入0.1 mL粗酶液，按照節(jié)1.2.5的方法測定吸光度值。以底物質量濃度的倒數(l/[S])為橫坐標，還原糖產生速率的倒數(1/V)為縱坐標，用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法作圖，求解褐藻膠裂解酶的Vm和Km。

1.2.8 重組褐藻膠裂解酶的酶解產物分析 取質量分數0.5%海藻酸鈉溶液30 mL，加入6 U褐藻膠裂解酶，35 ℃下反應，每小時取一次樣，測定還原糖含量，當還原糖含量穩(wěn)定時，補加3 U褐藻膠裂解酶繼續(xù)反應，直到還原糖含量再次穩(wěn)定。將反應液沸水浴10 min，冷卻后，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液即為酶解產物。將酶解產物上樣于液質聯用儀的進樣口中，通過液相色譜質譜聯用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)進行分析。液相分析條件為：采用ACQUITY BEH C18柱(2.1 mm× 150 mm，1.7 μm)，以流動相A(質量分數0.1%甲酸)和流動相B(體積分數100%乙腈)進行梯度洗脫，流速為0.3 mL/min。根據液相峰的不同，利用質譜檢測各峰的成分。

2 結果與分析

2.1 褐藻膠裂解酶活力

以海藻酸鈉為底物，利用DNS法測定得到的褐藻膠裂解酶的活力為11.6 U/mL。

2.2 單因素對褐藻膠裂解酶酶解海藻酸鈉的影響

2.2.1 反應溫度對酶解反應的影響 探究不同反應溫度對褐藻膠裂解酶降解褐藻膠的影響，結果如圖1所示。由圖1a可見，當反應溫度低于35 ℃時，反應溫度越高，還原糖生成量也隨之增高，其原因是：溫度升高使得底物的熱能被提高，導致反應速率加快進而增大了還原糖生成量。當反應溫度高于35 ℃時，還原糖生成量隨反應溫度的升高而減小，可能是溫度過高影響了酶的活力，使得還原糖生成量減少。當反應溫度在35 ℃和30 ℃時，還原糖生成量最大，在35 ℃下比在30 ℃下更快達到反應平衡。在此條件下，平均聚合度在反應60 min后降至2，此后聚合度無明顯下降(見圖1b)，這與還原糖生成量達到平衡的時間一致。因此，綜合考慮，反應溫度選35 ℃。

2.2.2 底物質量分數對酶解反應的影響 探究不同底物質量分數對褐藻膠裂解酶降解褐藻膠的影響，結果如圖2所示。由圖2a可見，當底物質量分數低于1.1%時，還原糖生成量隨底物濃度的增大而持續(xù)升高；當海藻酸鈉質量分數高于1.1%時，還原糖生成量明顯減小，可能是由于海藻酸鈉水溶液有一定粘性，濃度過大不利于底物擴散，從而降低反應效率；當底物質量分數為1.1%時，還原糖生成量達最大值。由圖2b可見，當底物質量分數為1.3%時，平均聚合度隨反應時間逐漸降低；當底物質量分數≤1.1%時，酶解體系的平均聚合度隨底物濃度的變化波動并不明顯，在酶解60 min時，平均聚合度均降至2，繼續(xù)酶解基本不變。綜合考慮，選擇底物質量分數為1.1%。

2.2.3 pH值對酶解反應的影響 酶活性中心上的催化基團中質子的受體或供體所需的離子化狀態(tài)以及必需基團的解離程度是影響酶解反應的重要因素，它們都會受到pH值的影響，進而影響酶與底物的結合。探究反應體系不同pH值對褐藻膠裂解酶降解褐藻膠的影響，結果如圖3所示。在pH<8.0時，pH值的變化對褐藻膠裂解酶的影響較大,除pH= 6.5外，體系內還原糖生成量隨著pH值的增加而升高；pH>8.0時，還原糖生成量隨反應時間增加而增加，180 min后呈下降趨勢；pH=8.0時還原糖生成量最大，在此條件下，隨反應時間的延長，還原糖生成量迅速增加，在180 min時還原糖生成量達最高(見圖3a)，平均聚合度穩(wěn)定在2左右(見圖3b)。因此，選擇pH=8.0。

2.2.4 加酶量對酶解反應的影響 探究反應體系不同加酶量對褐藻膠裂解酶降解褐藻膠的影響，結果如圖4所示。反應體系中添加不同的酶量，還原糖最終的生成量相近。加酶量為0.1 mL和0.2 mL的反應體系平衡趨勢相近；加酶量≥0.3 mL時，反應體系平衡趨勢相近，但平衡所用時間比加酶量為0.1 mL和0.2 mL時更短(見圖4a)，在底物一定的情況下，酶濃度增加，加快了反應速率，使其更快達到平衡狀態(tài)。在反應150 min時所有反應體系的DP值均達到2左右(見圖4b)。因此，為了節(jié)約成本，選擇加酶量0.1 mL。

2.2.5 振蕩速率對酶解反應的影響 探究反應體系不同振蕩速率對褐藻膠裂解酶降解褐藻膠的影響，結果如圖5所示。在各振蕩速率下，體系所產生的還原糖量均相同，平衡趨勢相近，到達平衡所用時間相同(見圖5a)。平均聚合度的變化也相似，在150 min時不同振蕩速率的反應，DP值均達2左右(見圖5b)。綜上所述，振蕩速率對酶解反應沒有明顯影響。因此，從節(jié)約能源的角度考慮，選擇不振蕩反應。不振蕩反應180 min，產生的還原糖質量濃度為7.09 g/L，平均聚合度為2。

2.3 動力學參數

測定褐藻酸鈉不同質量濃度時反應體系的反應初速率，按雙倒數作圖法作1/V-1/[S]曲線，結果如圖6所示。根據方程求得酶的Km為20.31 g/L，Vmax為2.68 U/mL。

2.4 酶解產物的質譜分析

利用AlgL17降解海藻酸鈉，將其酶解產物進行LC-MS分析。液相色譜峰圖中，海藻酸鈉降解物分別在保留時間5.28 min和6.94 min存在兩個主要峰(見圖7a)；未酶解海藻酸鈉的LC峰圖顯示在保留時間5.28 min和6.94 min不存在峰(見圖7b)。采用MS對液相主要峰進一步分析，在負離子模式下，產物平均聚合度和質荷比根據[DPx-H]-(x=1,2,3,4,5)定為1(質荷比為175)，2(質荷比為351)，3(質荷比為527)，4(質荷比為703)，5(質荷比為879)。從圖7c可知，液相色譜5.28 min的主峰中包括單糖、二糖和三糖產物；從圖7d可知，6.94 min的主峰中包括單糖、二糖、三糖和四糖產物。結果表明，海藻酸鈉經褐藻膠裂解酶AlgL17降解生成單糖、二糖、三糖和四糖。

3 結論

將來源于Microbulbifersp.ALW1的褐藻膠裂解酶基因Algl17在大腸桿菌中重組表達，重組的褐藻膠裂解酶AlgL17的最適酶解條件：反應溫度為35 ℃，pH=8.0，初始底物質量分數為1.1%，加酶量1.16 U，不振蕩反應180 min。達到平衡時，產生的還原糖質量濃度為7.09 g/L，產物的平均聚合度為2。LC-MS分析顯示，海藻酸鈉酶解終產物為單糖、二糖、三糖和四糖。