氧化應激對骨重建的影響

程韶 舒冰 趙永見 王晶 趙世天 陶渝仁 楊駿杰 張偉強 盧盛 王擁軍

1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 2.上海中醫(yī)藥大學脊柱病研究所，上海 200032 3.教育部重點實驗室(筋骨理論與治法)，上海 200032 4.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203

骨重建過程中穩(wěn)態(tài)的維持依賴于骨組織的形成與吸收功能之間的動態(tài)平衡，即骨形成相關細胞如骨髓間充質干細胞、成骨細胞、骨細胞與破骨細胞之間活性的平衡，一旦此平衡被打破，便會產生骨質疏松癥、骨質硬化癥等代謝性骨病[1]。近年來的研究表明[2-3]，活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導的氧化應激反應(oxidative stress，OS)會引起骨重建穩(wěn)態(tài)的改變，使骨吸收增加、骨形成減少，從而導致骨質疏松癥的發(fā)生。因此，對骨質疏松癥研究的重點逐步從以雌激素為中心轉向為以氧化應激為中心[4]，為骨質疏松癥的防治提供了新的思路。

1 氧化應激的產生

在線粒體通過呼吸鏈氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的過程中，伴隨著電子的漏出。呼吸鏈漏出的電子與氧分子(O2)在細胞色素P-450、單氧酶等酶的作用下生成超氧陰離子 O2-，此為細胞內初級ROS。之后超氧陰離子進一步通過一系列酶促反應形成羥自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)等次級活性氧，此途徑為細胞內ROS產生的主要來源，同時其他酶系如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶、環(huán)氧化酶、醛氧化酶、二氫乳清酸脫氫酶、色氨酸雙加氧酶、一氧化氮合酶、黃嘌呤氧化酶，也有助于細胞內ROS的產生[3]。此外，在衰老、雌激素缺乏、炎性細胞因子刺激、生長因子、環(huán)境毒素、化療藥物、紫外線或電離輻射刺激下機體內也會產生ROS[4-5]。正常情況下，細胞內的ROS作為次級信使，在調節(jié)信號通路、炎癥反應、組織修復、細胞的增殖凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用[6]。

機體針對ROS擁有一套完整的抗氧化系統(tǒng)，包括抗氧化酶體系和非酶類抗氧化體系，以防止ROS產生過多?？寡趸赴ǔ趸锲缁?superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)[7]，非酶類抗氧化物包括有抗壞血酸(維生素C)、維生素E、類胡蘿卜素、類黃酮、輔酶Q10、白蛋白等[8]。隨著機體的衰老，細胞內線粒體功能及抗氧化防御功能下降，使機體內ROS的產生與抗氧化清除失衡，引起氧化應激，導致細胞中脂質、糖類、蛋白質、DNA等大分子物質發(fā)生空間結構的變性、斷裂[9-10]，進而造成對細胞的氧化損傷。過量的ROS也增加了線粒體外膜的通透性，使促凋亡因子細胞色素C漏出，引起細胞凋亡[11]。同時隨著年齡增長，骨組織中ROS也日益增多[12]，通過對細胞因子、酶活性以及信號通路的調節(jié)，影響核內基因的轉錄表達，促使骨髓間充質干細胞、成骨細胞、骨細胞的凋亡和破骨細胞的增殖分化，使骨重建失衡，形成以骨吸收為主的代謝性骨病，從而導致骨質疏松癥。因此，ROS對于骨重建而言是一把雙刃劍，一方面是調節(jié)骨重建生理過程的重要信號分子，另一方面當其過量時也會成為有害物質影響骨重建的病理過程。

2 氧化應激對骨重建的影響

2.1 氧化應激對骨髓間充質干細胞的影響

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多種分化潛能，能夠向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞分化[13]。近年來研究表明，ROS能夠通過Wnt/β-catenin(Wingless Int1，Wnt)、磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT)、p53、非嘌呤非嘧啶核酸內切酶/氧化還原因子-1(Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1/Redox Factor-1，APE/REF-1)等多條信號通路的轉導途徑，誘導BMSCs的衰老凋亡、削弱其增殖和成骨分化能力，導致成骨細胞生成減少、骨量降低，使骨重建失衡。經典的Wnt/β-catenin信號通路能夠通過抑制脂肪形成相關轉錄因子CCAAT增強子結合蛋白(CCAAT enhancer binding protein，C/EBP)和過氧化物酶增殖活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorsγ，PPARγ)的表達使BMSCs更趨向于成骨細胞分化，在BMSCs定向分化中起到相當重要的作用[14]。Song等[14]研究表明，在敲除小鼠前成骨細胞中的β-catenin后，PPARr的表達增加，前成骨細胞分化為脂肪細胞，導致骨量減少和骨髓脂肪化。隨著ROS的增多引起的氧化應激，導致PPARr表達增加，激活蛋白酶體降解β-catenin[15]，由此削弱了BMSCs 通過Wnt/β-catenin途徑向成骨細胞定向分化，使成骨細胞生成減少脂肪細胞生成增多，從而影響骨形成及骨重建。PI3K/AKT信號通路參與了細胞在應激狀態(tài)下的生理調控，AKT磷酸化后提高了p38β的活性，使細胞內ROS水平降低，并抑制凋亡分子氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal protein kinase，JNK)的表達增加BMSCs的抗凋亡能力[16]。BMSCs中ROS增多時，通過p53及其下游p21Cip1(CDK-interacting protein1)抑制細胞周期蛋白依賴性激酶/細胞周期蛋白(cyclin-dependent kinase cyclin， CDK/cyclin)復合體的活性，促使BMSCs的衰老，p53轉錄因子還可上調Bax(Bcl-2 Assaciated X protein)、Bak(Bcl-2 homologous antagonist killer)等促凋亡因子，下調B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-x(B cell lymphoma-x，Bcl-x)等抗凋亡因子來促使BMSCs的凋亡[17]。APE/REF-1酶能夠修復ROS對機體造成的氧化性損傷，通過APE/REF-1信號途徑可阻礙細胞內ROS的聚集，防止BMSCs的衰老、調控其分化[18]。

2.2 氧化應激對成骨細胞的影響

成骨細胞(osteoblast，OB)來源于BMSCs，負責合成、分泌、礦化細胞外基質，參與骨形成。Wnt/β-catenin通路的激活能夠促進BMSCs的增殖、OB分化以及抑制OB的凋亡[19]。β-catenin蛋白是Wnt/β-catenin通路中的關鍵蛋白，該通路激活后β-catenin能夠進入細胞核，激活轉錄因子T細胞因子/淋巴細胞增強因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)，引起成骨相關基因Runx2、Osterix的表達，促進OB分化。FoxO轉錄因子家族能夠保護細胞免于ROS損傷以及維持骨內穩(wěn)態(tài)，當細胞中ROS增多時，引起FoxO的基因表達上調，轉錄后能夠使抗氧化酶包括線粒體中的MnSOD(SOD2)和細胞中CAT的表達增加，以清除ROS[20]，通過對細胞抗氧化特性的調節(jié)，調節(jié)細胞的增殖分化，從而調控BMSCs向OB分化[4]。β-catenin作為FoxO轉錄的激活因子，當ROS過多時，為了抵抗氧化應激的影響，引起FoxO與Wnt通路競爭性結合β-catenin增多，從而將細胞內有限的β-catenin從Wnt通路中的TCF/LEF轉錄轉向FoxO轉錄，導致OB的生成和增殖分化減少，降低了骨形成[21]。隨著機體衰老導致氧化應激增加，促使FoxO結合了更多的β-catenin，使Wnt/β-catenin通路的表達降低，從而導致骨形成減少和骨量丟失，這或許可以解釋老年性骨質疏松癥的發(fā)病機制。以上研究證實，ROS能夠干預OB的增殖分化，進而影響骨重建。

2.3 氧化應激對骨細胞的影響

在成骨細胞成熟的過程中大約有20%[22]的成骨細胞嵌入到其分泌的細胞外基質中，成為類骨質骨細胞，之后隨著類骨質的礦化及骨細胞樹突的逐漸形成，最終發(fā)育為成熟骨細胞，骨細胞能夠將其對機械載荷的反應信號通過樹突向骨表面的成骨細胞和破骨細胞進行傳遞并調節(jié)它們的活性[23]。最近研究表明[22,24]，成熟骨細胞在骨重建的過程中起到了核心的調節(jié)作用，除了對成骨細胞和破骨細胞的活性調節(jié)外，骨細胞還可通過移除替代骨陷窩周圍的有機和無機成分，重塑骨陷窩周圍的生物學微環(huán)境，以維持骨的功能活力及正常的礦化水平。ROS不僅能夠誘導骨細胞的凋亡，抑制骨質礦化和骨形成，還可促進破骨細胞的增殖分化，增強骨吸收，導致骨轉換亢進和骨量丟失[2,25]。骨細胞能夠分泌多種因子調節(jié)成骨細胞、破骨細胞的活性及骨重建的過程，其中最主要的是核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)和骨硬化蛋白(sclerostin)[26]。RANKL能夠和RANK結合促進破骨細胞的增殖分化提高破骨細胞的活性；OPG由Wnt/β-catenin信號通路激活后所產生，能夠和RANKL綁定結合，從而抑制破骨細胞的活性；sclerostin是骨細胞分泌的Wnt/β-catenin信號通路的抑制蛋白，對骨形成起到負性調節(jié)作用[22]。有學者[27-28]研究表明，ROS能夠激活JNK和細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)信號通路引起骨細胞中RANKL及sclerostin的表達上調，OPG的表達下調，使RANKL/OPG的比值升高，并激活caspase-3誘導骨細胞的凋亡。即ROS能夠誘導骨細胞的凋亡降低骨形成，從而打破骨形成與骨吸收之間的動態(tài)平衡，改變骨重塑的過程。

2.4 氧化應激對破骨細胞的影響

破骨細胞(osteoclast，OC)來源于骨髓造血干細胞，是一種多核細胞，通過向細胞外分泌HCl和溶解酶來溶解周圍骨組織，因此能量消耗巨大，胞內含線粒體豐富，而線粒體所產生的ROS尤其是H2O2對OC的增殖分化及功能的調控具有重要的作用。Baek等[29]向人來源的骨髓單核細胞中加入H2O2培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，H2O2能夠增加OC的活性，促進抗酒石酸酸性磷酸酶的表達，刺激巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、RANKL的表達，使RANKL/OPG的比值升高，導致OC數(shù)量增加，表明氧化應激參與OC的生成，可引起骨吸收的增強，骨量的減少。腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor α，TNF-α)作為骨吸收誘導劑，不僅能夠促進破骨前體細胞的增殖分化，提高其對破骨因子RANKL的敏感性，增強骨吸收，還可通過Wnt/β-catenin信號通路抑制BMSCs向OB的分化[30-31]。RANKL也稱為與TNF相關的激活誘導細胞因子，在成骨細胞、骨細胞、干細胞和T細胞中均有表達[32]，通過與OC前體細胞表面的RANK結合，調節(jié)OC的成熟分化。OPG可由成骨細胞、骨細胞等分泌，作為RANKL的誘導受體，阻止RANKL與RANK的結合，調節(jié)OC的增殖分化，抑制骨吸收。與Baek等[29]研究證實的ROS直接參與骨吸收不同，有學者研究表明ROS還能夠通過激活ERK、JNK、NF-κB等信號通路，上調RANKL、TNF-α的表達，下調OPG的表達，提高骨吸收功能，間接地影響骨重建過程[4,27,32]。因此，ROS一方面能夠通過直接或間接的作用促進破骨前體細胞向破骨細胞的分化，提高破骨細胞的活性及數(shù)目，加強骨吸收；另一方面ROS還可抑制BMSCs向OB的分化降低骨形成，從而進一步導致骨吸收增加。

3 骨質疏松癥的抗氧化治療

由于氧化應激及ROS在骨重建過程中的重要作用，因此對于使用抗氧化物治療骨質疏松癥的研究引起了越來越多學者的關注。體內外實驗研究表明，食物中所含的多酚類化合物具有抗氧化特性，能夠預防心血管疾病、糖尿病、骨質疏松癥等疾病[33]。綠茶中含有多種類型的茶多酚，具有抗氧化特性，能夠減少骨量和骨基質中膠原的流失，抑制成骨細胞的衰老，降低破骨細胞的分化及骨吸收，預防卵巢切除大鼠骨質疏松癥的形成[34-35]。白藜蘆醇是一種天然多酚類抗氧化物，能夠提高骨質疏松患者的骨密度及骨堿性磷酸酶的表達[36]。Tou[37]研究表明，白藜蘆醇能夠通過降低老齡大鼠和卵巢切除大鼠的氧化應激，防止骨量丟失。中藥丹參成分中丹參酚酸類的結構和白藜蘆醇極其相似，也是天然抗氧化的有效成分，能提高機體SOD的活性，清除ROS，減少氧化應激引起的骨質疏松大鼠中成骨細胞的凋亡[38]。黃酮類化合物具有抗氧化、促進成骨、抑制破骨等作用。其中骨碎補總黃酮、淫羊藿總黃酮、大豆異黃酮等黃酮類化合物已被證實具有抗骨質疏松的活性，其相應的活性成分有柚皮苷、淫羊藿苷、大豆苷元等[39]。吳新濤等[40]通過使用柚皮苷的主要代謝產物柚皮素干預H2O2處理后的成骨細胞，結果表明柚皮素促進在氧化應激條件的成骨細胞增殖，抑制其凋亡，上調Bcl-2并下調Bax、Caspase-3表達。孫振雙等[41]則使用中藥湯劑溫腎固疏方觀察其對去卵巢大鼠骨密度、骨代謝及氧化應激指標的影響，結果表明中藥湯劑溫腎固疏方能夠增加骨形成，降低骨吸收，提高血清中SOD的水平，具有抗骨質疏松及抗氧化應激作用。鑒于氧化應激與動脈粥樣硬化及骨質疏松癥之間密切的聯(lián)系[15]，通常用于高脂血癥的辛伐他汀類藥物，由于其具有抗氧化的特性，Moon等[42]將其用于骨質疏松方面的研究，結果表明辛伐他汀能夠減少單核巨噬細胞(破骨細胞前體細胞)中ROS的生成，下調破骨細胞形成的相關通路，抑制破骨細胞的生成分化，降低其骨吸收活性，為骨質疏松癥及病理狀態(tài)的骨吸收提供了新的治療思路。

4 小結

綜上所述，氧化應激通過對相關分子和信號通路的調節(jié)引起了骨重建的生理過程中骨髓間充質干細胞成骨分化減弱、成骨細胞的生成減少、骨細胞凋亡增加、破骨細胞活性增強等細胞增殖分化的改變，介導了骨質疏松癥的發(fā)生發(fā)展，但其具體作用機制尚未完全闡明，今后仍需通過基礎研究進一步探究氧化應激在骨重建及骨質疏松癥中的作用機制。同時，我國擁有豐富的中醫(yī)藥資源，立足于中藥抗氧化的研究或許可為骨質疏松的防治提供新的方法，具有良好的科研前景。