NMDA受體相關的聽覺神經(jīng)疾病的研究現(xiàn)狀

黃喜劉佩強覃丹雪葉文華林曉宇蘇紀平*

1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（南寧530021）

2武漢市第一醫(yī)院（武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院）耳鼻咽喉頭頸外科（武漢430022）

谷氨酸是哺乳動物體內(nèi)最重要的興奮性氨基酸遞質(zhì)，主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)，儲存于突觸前膜囊泡中，釋放后與谷氨酸離子型受體和代謝型受體結(jié)合，其中谷氨酸離子型受體分為NMDAR、AMPA受體（AMPAR）、海人藻酸受體（KA受體、KAR）。其中NMDAR作為重要的興奮性氨基酸遞質(zhì)受體，介導一種緩慢而持久的興奮性反應，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是突觸可塑性、維持神經(jīng)元生理性突觸傳遞、誘導長時程增強（long term potentiation,LTP）相關功能（學習和記憶）的基礎。帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、癲癇等諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展及病理生理過程中也伴隨著NMDAR表達的改變。

近年來，NMDAR在聽覺系統(tǒng)中的作用的研究日益增加，已發(fā)現(xiàn)NMDAR在聽覺傳導通路的各級神經(jīng)元均有表達，參與聽覺發(fā)育[1,2]、神經(jīng)保護[3-5]、聲音定位[6,7]、聽覺信號的傳遞[8,9]等過程。另一方面，也發(fā)現(xiàn)NMDAR過度激活與水楊酸鈉致耳鳴[10-13]、噪聲性聽覺損傷[14-17]、老年性聾[18,19]、藥物性耳聾[20]等聽覺疾病密切相關，是這些難治性耳聾晚期病理的交匯點，也成為突破難治性耳聾治療的潛在靶點。因此，明確NMDAR在聽覺神經(jīng)系統(tǒng)的分布以及在聽覺系統(tǒng)疾病中的作用有助于進一步探討聽覺系統(tǒng)疾病的病理機制，尋找新的治療靶點，為研發(fā)具有靶向性的藥物提供理論依據(jù)。本文就NMDAR在聽覺系統(tǒng)中的分布及NMDAR相關的聽覺神經(jīng)疾病的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 NMDAR的生理及病理作用

NMDAR由NR1,NR2A-D和NR3A-B這七種同源基因編碼的七種亞基組成，在所有的NMDAR亞基中，NR1是構(gòu)成NMDAR復合物以及實現(xiàn)其離子通道功能的基本亞基，NR2的四種亞基NR2A-2D是NMDAR功能異質(zhì)性的主要影響因素。興奮性神經(jīng)元突觸上NMDAR主要由NR1∕NR2A組成或NR1∕NR2A∕NR2B組成[21]。

NMDAR-通道是陽離子通道，除通透Na+和K+外，對Ca2+具有較大的通透性。靜息狀態(tài)下，NMDAR被細胞外的Mg2+阻滯而處于抑制狀態(tài)，動作電位產(chǎn)生后，神經(jīng)細胞突觸后膜發(fā)生去極化，Mg2+抑制解除，在配體作用下，NMDAR通道開放，Ca2+等陽離子內(nèi)流。NMDAR作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中正常的興奮性氨基酸受體的一種，具有誘導長時程增強（因而與學習記憶相關）、控制發(fā)育過程中大腦神經(jīng)元回路的結(jié)構(gòu)及突觸可塑性、維持正常的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等重要生理功能[22]。

在藥物損傷、噪聲、缺血缺氧等病理狀態(tài)下，細胞能量代謝障礙，ATP生成下降，導致神經(jīng)細胞對谷氨酸攝取率下降，胞外谷氨酸大量積聚而使神經(jīng)細胞處于高濃度的谷氨酸環(huán)境中，致NMDAR過度激活，Ca2+大量內(nèi)流，胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)升高引起一系列生理病理反應，特別是激活磷脂酶C、磷脂酶A2、Ca2+激活神經(jīng)元蛋白酶I和II、PKC、NO合酶、核酸內(nèi)切酶等多種降解酶，破壞神經(jīng)元的脂質(zhì)膜、核酸、細胞骨架蛋白等重要成分，使神經(jīng)元逐步潰變壞死。此外，Ca2+超載可觸發(fā)自由基連鎖反應，而大量的自由基又致使胞內(nèi)的Ca2+進一步增加，如此惡性循環(huán)，最終使神經(jīng)元變性乃至死亡，這便是NMDAR興奮毒性的主要后果[23]。

2 NMDAR在聽覺神經(jīng)系統(tǒng)中的分布

現(xiàn)有研究表明NMDAR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量分布，其中NR1廣泛分布于各個腦區(qū)和脊髓。NR2分布具有明顯的區(qū)域差異性，其中NR2A和NR2B主要分布于端腦和間腦，NR2C主要表達與小腦，NR2D主要表達于中腦與間腦。NR3A較為廣泛地分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)各區(qū)域，NR3B主要表達于運動神經(jīng)元和腦干中[24]。

聽覺動作電位的興奮性活動起始自耳蝸內(nèi)毛細胞（inner hair cell，IHC）突觸的前后膜，經(jīng)神經(jīng)末梢傳遞到位于蝸軸的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（spiral ganglion neuron，SGN），信號經(jīng)蝸神經(jīng)至蝸核-上橄欖核復合體-外側(cè)丘系-下丘-內(nèi)側(cè)膝狀體-聽皮層這一通路產(chǎn)生聽覺活動。NMDAR作為重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體，在該通路的各級神經(jīng)元均有不同程度表達。

2.1 IHC-SGN的突觸

Nordang等[25]利用免疫組織學方法檢測到谷氨酸與NR2B在人類耳蝸IHC與OHC（outer hair cell,外毛細胞）及SGN突起上均有分布。Niedzielski等[26]通過分子生物學技術檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠SGN上除有NR1外，NR2A-2D亦有大量表達。我們的研究也證實，大鼠SGN胞體與突起上有NR1、NR2A-D、NR3A-B等亞基的mRNA均有不同程度的表達，且表達除NR1外由高到低依次為：NR2B、NR3A、NR2D、NR3B、NR2A、NR2C[27]。在哺乳動物的IHC-SGN突觸上，NMDAR的亞單位表達在個體的不同生長階段各有不同。早期聽覺發(fā)育階段，主要是NR1與NR2A的表達；聽覺發(fā)育成熟階段，除NR1的表達顯著下降外，NR2A幾乎不再表達，而NR2B、NR2C、NR2D等亞基的表達水平相對升高，這與哺乳動物其他聽覺核團的發(fā)育過程中NR2B表達下降、NR2A表達升高相反[19]。

2.2 蝸核（Cochlear nucleus,CN）

Bilak等[28]運用免疫細胞化學、原位雜交技術檢測大鼠DCN（背側(cè)蝸核）發(fā)現(xiàn)NR1高度表達于除顆粒細胞以外的CN神經(jīng)元上。光學記錄膜電位方法觀察CN的神經(jīng)電活動發(fā)現(xiàn)，谷氨酸受體NMDAR參與介導了CN神經(jīng)元興奮性突觸后電位（excitato-ry postsynaptic currents,EPSCs）。且相比較于DCN中的EPSCs，NMDAR在VCN（腹側(cè)蝸核）中介導的EPSCs更大[29]。

2.3 下丘（Inferior colliculus,IC）

Shim等[30]運用免疫組化法檢測到，在SD大鼠IC上，NMDAR隨著年齡的增長表達顯著降低。RT-PCR法檢測到水楊酸鈉鈉致耳鳴大鼠的IC中NR2B的mRNA明顯升高[13]。大鼠IC中央核上可記錄到NMDAR介導的遲發(fā)性EPSCs，且可被NMDAR特異性阻斷劑APV（DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid,DL-2-氨基-5-膦?；i草酸）或CPP（(RS)-3-(2-carboxypiperazin-4-yl)-propyl-1-phosphonic acid，（RS）-3（2-羧基哌嗪-4-基）丙基-1-膦酸）阻斷[31]。Cong等[32]也證實了體外培養(yǎng)的大鼠IC神經(jīng)元上有NMDAR電流存在。

2.4 內(nèi)側(cè)膝狀體（medial geniculate body,MGB）

MGB分為背側(cè)部分（MGBd）、腹側(cè)部分（MGBv）和內(nèi)側(cè)部分（MGBm）。已知NMDAR在大鼠MGB上高度表達，且表達隨著年齡的增長而升高。NMDAR在老年大鼠（出生后24月）的表達量顯著高于幼年大鼠（出生后2周）[30]。同時，原位雜交法檢測到：出生早期的大鼠MGB上，NR2A表達極低，而NR2B呈中度表達，但在兩周后，二者表達均迅速升高，NR2A主要分布在MGBm，NR2B則在MGBv高度表達[33]。全細胞膜片鉗記錄法顯示，NMDAR拮抗劑APV可顯著抑制皮層中MGBd和MGBv神經(jīng)元的EPSCs的持續(xù)時間及峰值，推測MGB中NMDAR誘發(fā)的EPSCs可能是MGB接受下丘的聽覺纖維繼而投射到聽覺中樞這一過程的生理基礎[34]。

2.5 聽皮層（auditory cortex,AC）

NR1、NR2A、NR2B在AC上均有表達，且具有時間差異性。出生后35天以內(nèi)的大鼠的AC中，NR1的表達量逐漸升高，且在出生后7、14天尤為顯著，在聽覺發(fā)育的關鍵期（出生后7-21天）予以單側(cè)聽覺剝奪時，NR1表達量明顯降低[35]。原位雜交法也證實在大鼠AC中，NR2A在出生后早期的表達很低，在出生兩周后急劇增加，但NR2B在出生后一直保持高水平[33]。此外，亦有發(fā)現(xiàn)NR2A主要存在于大鼠AC神經(jīng)元的胞膜與胞漿內(nèi)[36]。

2.6 其他聽覺核團

研究已證實，上橄欖核復合體（SOC）和外側(cè)丘系（LL）上亦檢測到NR1、NR2A-D的表達，且NR1的表達明顯高于NR2[37]。其中NR1在大鼠LL上的分布隨著發(fā)育階段而變化，于出生后前兩周高表達，隨后逐漸下降[38]。

3 NMDAR相關的聽覺神經(jīng)疾病

NMDAR被谷氨酸等興奮性氨基酸激活后，介導一種緩慢而持久的興奮性反應。NMDAR獨特的亞基組成及發(fā)育規(guī)律有助于聽覺信號的興奮性傳導，在聽覺發(fā)育的關鍵期的突觸可塑性過程中發(fā)揮重要作用。然而，NMDAR過度激活導致的興奮毒性與水楊酸鈉致耳鳴、噪聲性聽覺損傷、老年性聾、藥物性耳聾等多種聽覺神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。

3.1 水楊酸鈉致耳鳴

水楊酸鈉致耳鳴的機制復雜，假設眾多，研究證實水楊酸鈉可導致聽覺傳導通路中谷氨酸及NMDAR各亞基表達發(fā)生改變。

水楊酸鈉作用于大鼠后，其耳鳴評分逐日增高，耳蝸、DCN、IC、AC和中腦上檢測到NR2B的mRNA表達呈中度升高，AC上NR2A的mRNA亦明顯增高，在停藥后的14天，NR2B表達恢復正常，且耳鳴評分與耳蝸、IC中TNF-a,IL-1b和NR2B的表達水平呈正相關[13,39-42]。推測這些促炎因子表達的升高導致耳鳴可能是影響NMDAR功能所實現(xiàn)的。劉等[43]利用活體微透析技術發(fā)現(xiàn)，水楊酸鈉致耳鳴大鼠模型的下丘中，谷氨酸水平明顯升高。全細胞膜片鉗記錄顯示，阿司匹林能顯著增強大鼠SGN上NMDAR誘導的電流，且該電流可被NMDAR拮抗劑APV或Mg2+所阻斷[44]。當單獨使用環(huán)氧合酶（cyclooxygenase,COX）抑制劑Mefenamate時，亦可引起水楊酸鈉致耳鳴類似的效應，推測水楊酸鈉致耳鳴可能是通過抑制COX，進而阻礙花生四烯酸的代謝，花生四烯酸的積累又反過來增強NMDAR誘導的電流引起的[11]。表明NMDAR活性在水楊酸鈉致耳鳴中具有重要作用。

水楊酸鈉是誘導動物耳鳴模型的經(jīng)典藥物，水楊酸鈉致耳鳴的機制涉及形態(tài)學、藥理學、分子生物學、電生理等多個層面，但其確切機制尚無法闡釋清楚。NMDAR相關的受體機制的研究是對水楊酸鈉致耳鳴機制的重要補充，因此NMDAR在水楊酸鈉致耳鳴中的研究具有十分重要的意義且亟待更進一步的研究。

3.2 噪聲性聽覺損傷

噪聲按時間變化的屬性分為脈沖噪聲與穩(wěn)態(tài)噪聲，二者引起聽覺損傷的機制不同。脈沖噪聲損傷對聽器主要是機械性損傷，如毛細胞損傷、前庭膜破裂、網(wǎng)狀膜破裂、corti器從基底膜上剝離。而穩(wěn)態(tài)噪聲損傷對聽器主要是代謝性損傷。如內(nèi)耳過量自由基產(chǎn)生、內(nèi)耳局部缺血、谷氨酸興奮毒性、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等。脈沖噪聲一般在機械性損傷之后亦繼發(fā)代謝性損傷。耳蝸微循環(huán)障礙為兩種不同類型噪聲性聽覺損傷后期的共同通路。在代謝性損傷中，谷氨酸興奮毒性正受到越來越多的關注。噪聲刺激下，IHC上谷氨酸大量釋放除了過度激活AMPAR或KAR，導致與IHC相連的I型SGN傳入樹突急性破壞，還會過度激活NMDAR，引起Ca2+大量內(nèi)流，觸發(fā)自由基產(chǎn)生、蛋白酶、核酸內(nèi)切酶的激活等級聯(lián)代謝性事件，最終致SGN的死亡[45]。

Dong等[46]研究發(fā)現(xiàn)在大鼠噪聲暴露的急性損傷期，同側(cè)及對側(cè)CN、IC的NR1的mRNA表達均降低，但2周和4周時其NR1的mRNA表達均升高，提示CN和IC的NMDAR參與了噪聲性耳聾的后期發(fā)生發(fā)展過程。Wang等[47]觀察到，噪聲暴露2小時后的大鼠AC的NR2A蛋白表達量明顯升高，但噪聲暴露3小時后的72小時，NR2A蛋白表達量不再改變，而NR1、NR2B蛋白表達量始終無明顯變化。此外，大鼠噪聲下分別暴露24小時、3天、10天后，聽性腦干反應的反應域上移，SGN上NR1的mRNA表達量逐漸升高，而AC和IC上NR1的mRNA表達量則逐漸降低[48]。Brozoski等[49]報道，噪聲誘導的耳鳴大鼠的CN的電活動明顯增強，NMDAR拮抗劑D-APV能抑制這種效應，推測NMDA介導的谷氨酸能的遞質(zhì)傳遞及CN電活動的增強與噪聲誘導的耳鳴相關。

噪聲性聽覺損傷是機械性損傷與代謝型損傷綜合作用的結(jié)果，其中代謝型損傷中的谷氨酸興奮毒性在噪聲性聽覺損傷發(fā)生發(fā)展過程中的作用至關重要。因此，谷氨酸受體NMDAR的相關研究不僅在噪聲性聽覺損傷中的發(fā)病機制中具有重大意義，而且對于開發(fā)預防噪聲性聽覺損傷的藥物上具有極大的研究價值。

3.3 老年性聾

免疫組化法顯示老年大鼠聽皮層的谷氨酸含量明顯升高，推測過量谷氨酸聚集在突觸后膜與谷氨酸受體相結(jié)合，導致膜內(nèi)外某些離子（如Cl-和Ca2+）失衡，線粒體不可逆損傷，氧自由基大量產(chǎn)生，繼而引起聽覺神經(jīng)元受損乃至死亡[50]。

通過對比老年大鼠（出生后24月）與年幼大鼠（出生后2周）聽覺系統(tǒng)中NMDAR中的表達變化，發(fā)現(xiàn)相比較于年幼大鼠，老年大鼠的CN、MGB、AC上的NMDAR表達量明顯升高，而在SOC和IC上表達降低[30]，SOC和IC上NMDAR表達量下降可能的原因是為緩解NMDAR興奮毒性導致的保護性受體表達量下降，是機體避免興奮毒性進一步發(fā)生的保護性反射。我們研究也發(fā)現(xiàn)大鼠SGN上NR1的mRNA和蛋白的表達隨著大鼠年齡的增長而升高，推測SGN上NR1表達升高改變了耳蝸的突觸傳遞，是外周聽覺系統(tǒng)在耳蝸神經(jīng)細胞老化功能衰退后維持聲信號傳入興奮性的一種代償機制[18]。而Peng等[51]認為，老年性聾大鼠SGN上NR1的表達上調(diào)可能是通過恢復相關突觸連接代償老年大鼠SGN的變性死亡。

老年性聾的發(fā)生發(fā)展可能是個體因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。隨著年齡增長，不同聽覺核團NMDAR的表達發(fā)生顯著改變，且變化趨勢不完全一致，這可能與NMDAR在不同部位所起作用不同有關，具體的機制仍需大樣本不同年齡段動物的不同聽覺核團重NMDAR表達的進一步研究。

3.4 藥物性耳聾

目前已知的耳毒性藥物有近百余種，常見的有氨基糖苷類抗生素、抗瘧藥、抗腫瘤制劑、水楊酸鹽類止痛藥、利尿劑等。不同藥物的損傷靶點及機制不同，如直接損傷毛細胞的膜性結(jié)構(gòu)，破壞膜通透性，破壞線粒體結(jié)構(gòu)，破壞內(nèi)耳血管紋造成內(nèi)外淋巴液生化成分改變等，但是并沒有深入到分子和受體水平的研究。Bieńkowski[52]發(fā)現(xiàn)，氨基糖苷類抗生素可通過與NMDAR多胺調(diào)節(jié)位點相互作用增強NMDAR的功能引起大鼠耳聾，且NMDAR拮抗劑艾芬地爾（ifenprodil）及MK-801可減弱氨基糖苷類抗生素的致聾作用。推測大劑量的氨基糖苷類抗生素可通過NMDAR離子通道介導Ca2+大量內(nèi)流，促進毛細胞與耳蝸神經(jīng)纖維的變性死亡，繼而引起耳聾[52]。

藥物性耳聾的致病機制因藥物不同而異，目前的研究顯示，只有氨基糖苷類藥物致耳聾的致病機制的研究深入到受體水平，更多與NMDAR相關的藥物性耳聾的研究仍是有必要的。

4 小結(jié)與展望

NMDAR廣泛分布于聽覺神經(jīng)系統(tǒng)，具有重要的生理作用，也與水楊酸鈉致耳鳴、噪聲性聽覺損傷、老年性聾、藥物性耳聾等聽覺神經(jīng)疾病密切相關，拮抗NMDAR的藥物研究具有重要意義，但大部分藥物因難以克服的副反應限制了其在臨床上的應用。NMDAR結(jié)構(gòu)復雜，作用位點眾多，決定了NMDAR功能受多種因素的影響，既能減輕NMDAR介導的興奮毒性，又不干擾NMDAR的正常生理功能的藥物的研制將是今后的主要研究方向。