膽紅素對(duì)離體小鼠耳蝸組織毒性作用的研究

徐浩 林昶

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（福州350001）

2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，福建省耳鼻咽喉研究所（福州350005）

高膽紅素血癥是新生兒常見(jiàn)疾病，生理性黃疸對(duì)于新生兒是具有保護(hù)作用的。但隨著膽紅素濃度的升高，會(huì)出現(xiàn)病理性黃疸，從而造成神經(jīng)系統(tǒng)損害。聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)于膽紅素毒性最敏感的部分。大量的觀察性實(shí)驗(yàn)表明高膽紅素血癥和聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損傷有很大的關(guān)系[1-3]。膽紅素導(dǎo)致螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度降低和聽(tīng)神經(jīng)的髓鞘神經(jīng)纖維減少[6,7]。核黃疸大鼠研究發(fā)現(xiàn)，膽紅素主要破壞耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)，造成螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元發(fā)生嚴(yán)重的變性，并且破壞表面附有髓鞘的聽(tīng)神經(jīng)纖維，而內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞無(wú)形態(tài)學(xué)改變[4]。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激是膽紅素引起神經(jīng)損傷的機(jī)制之一。非結(jié)合膽紅素（Unconjugated bilirubin，UCB）會(huì)干擾神經(jīng)元正常的氧化還原狀態(tài)，使細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基ROS、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物、蛋白氧化產(chǎn)物都明顯升高[5]。

本研究用含不同濃度的膽紅素培養(yǎng)基離體培養(yǎng)新生小鼠耳蝸組織，探索其濃度與耳蝸損傷的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生5天的C57BL∕6J小鼠30只，SPF級(jí)，體重(2.00±0.30)g，雌雄不限，由福州吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 耳蝸組織取材及培養(yǎng)[13]

將出生5天的C57BL∕6J小鼠引頸處死，解剖顯微鏡下將耳蝸完整取出，用游絲鑷挑開(kāi)骨性蝸殼，暴露膜迷路，去除螺旋韌帶及血管紋，順序從底轉(zhuǎn)到頂轉(zhuǎn)將基底膜組織與蝸軸分離，得到帶有螺旋神經(jīng)節(jié)和柯蒂氏器的耳蝸基底膜組織；移入含無(wú)血清DME∕F12培養(yǎng)基液的35mm培養(yǎng)皿上，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育48h。每24h，更換培養(yǎng)基。

1.2.2 膽紅素不同濃度的作用

選擇生長(zhǎng)良好的耳蝸組織，共40個(gè)，將其隨機(jī)分為四組。實(shí)驗(yàn)組：25μmol∕L膽紅素組、50μmol∕L膽紅素組、100μmol∕L膽紅素組，各實(shí)驗(yàn)組加入相應(yīng)的膽紅素溶液使其達(dá)到相應(yīng)的終濃度；對(duì)照組加入等體積生理鹽水。避光培養(yǎng)24小時(shí)終止培養(yǎng)，4%多聚甲醛溶液固定。

1.2.3 免疫熒光染色

0.01M PBS清洗5min×3次，加入一抗myosinⅦa（1：200，Proteus BioSciences公司），4℃孵育12h；0.01M PBS清洗10min×3次；加入一抗NF-200（1：200，Abcam公司），4℃孵育12h；0.01M PBS清洗10min×3次，加入alexa fluor 488標(biāo)記的羊抗雞二抗（1：200，Thermo公司），避光常溫孵育1h,0.01M PBS清洗10min 3次,加入alexa fluor 568標(biāo)記的驢抗兔二抗（1：200，Thermo公司），避光常溫孵育1h；0.01M PBS清洗10min 3次。共聚焦顯微鏡觀察（LSM780，Zeiss公司）。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

螺旋神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)纖維及內(nèi)外毛細(xì)胞統(tǒng)計(jì):每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取寬度為100μm的中回組織進(jìn)行內(nèi)毛細(xì)胞（Inner hair cell，IHC）和外毛細(xì)胞（Outer hair cell，OHC）與螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)纖維（Nerve fibers，NF）計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)完成后以x±s表示，并用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)及免疫熒光染色

新生5天小鼠的耳蝸組織體外培養(yǎng)48小時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)透亮的毛細(xì)胞，結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，生長(zhǎng)良好，根據(jù)形態(tài)，能清楚的分辨出一排內(nèi)毛細(xì)胞和三排外毛細(xì)胞（圖1）。免疫熒光染色后，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察，可見(jiàn)一排內(nèi)毛細(xì)胞和三排外毛細(xì)胞被染成紅色，內(nèi)毛細(xì)胞呈窄口寬底的燒瓶狀，外毛細(xì)胞呈上下均大的圓柱狀；螺旋神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)纖維被染成綠色，神經(jīng)纖維密集，排列整齊（圖2）。

圖1 倒置顯微鏡觀察耳蝸組織：×400，IHC：內(nèi)毛細(xì)胞；OHC1：第一排外毛細(xì)胞；OHC2：第二排外毛細(xì)胞；OHC3：第三排外毛細(xì)胞。Fig.1 The cochlea tissue was observed by an inverted microscope:×400，IHC：Inner hair cells;OHC1：outer hair cells in the first row;OHC2：outer hair cells in the second row;OHC3：outer hair cells in the third row.

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察耳蝸組織免疫熒光結(jié)果：×400，NF：神經(jīng)纖維；IHC：內(nèi)毛細(xì)胞；OHC1：第一排外毛細(xì)胞；OHC2：第二排外毛細(xì)胞；OHC3：第三排外毛細(xì)胞。Fig.2 The cochlea tissues stained by immunofluorescence were observed by laser confocal microscopy:×400，NF：nerve fiber;IHC：Inner hair cells;OHC1：outer hair cells in the first row;OHC2：outer hair cells in the second row;OHC3：outer hair cells in the third row.

2.2 膽紅素對(duì)耳蝸組織的毒性作用

2.2.1 膽紅素對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)纖維的作用

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，各膽紅素組的神經(jīng)纖維數(shù)與對(duì)照組的神經(jīng)纖維數(shù)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且各個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的神經(jīng)纖維數(shù)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3、4）（表1）

圖3激光共聚焦顯微鏡下不同濃度膽紅素處理后的螺旋神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)纖維、內(nèi)毛細(xì)胞及外毛細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，×400。Fig.3 The growth of nerve fibers of spiral ganglion,inner hair cells and outer hair cells treated with different concentrations of bilirubin under a confocal laser microscope，×400.

圖4不同濃度膽紅素處理后的螺旋神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)纖維數(shù)量；*表示該組與對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；#表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Fig.4 The number of nerve fibers in the spiral ganglion treated with different concentrations of bilirubin;*indicates that the difference between this group and the control group is statistically significant;#indicates that the differences between groups are statistically significant.

2.2.2 膽紅素對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的作用

各膽紅素組的內(nèi)外毛細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組的內(nèi)外毛細(xì)胞數(shù)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且各膽紅素組之間的毛細(xì)胞數(shù)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖5、6）（表2、3）。

圖5不同濃度膽紅素處理后的內(nèi)毛細(xì)胞數(shù)量。Fig.5 The number of inner hair cells treated with bilirubin at different concentrations

圖6不同濃度膽紅素處理后的外毛細(xì)胞數(shù)量。Fig.6 The number of outer hair cells treated with different concentrations of bilirubin

3 討論

適宜水平的膽紅素對(duì)人體是有益的，是人體內(nèi)一種強(qiáng)有效的內(nèi)源性抗氧化劑，可有效清除自由基。但過(guò)高的膽紅素濃度對(duì)人體是有害，可對(duì)大腦和神經(jīng)造成不可逆的損害。新生兒黃疸在新生兒時(shí)期是很常見(jiàn)的，UCB增高是最常見(jiàn)的形式?？偰懠t素一般是輕度的一過(guò)性增高[9]，對(duì)于大多數(shù)的嬰兒不會(huì)造成影響，只有小部分嬰兒會(huì)出現(xiàn)影響終生的后遺癥，以神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙為多見(jiàn)。膽紅素所致的神經(jīng)功能障礙，是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)短暫地或者持續(xù)地接觸膽紅素所致的一系列的神經(jīng)損傷。膽紅素所致的神經(jīng)功能障礙包括核黃疸，急性膽紅素腦病和獨(dú)立的神經(jīng)通路功能障礙。[10]聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)對(duì)于膽紅素的敏感性是有據(jù)可查的，大量的觀察性實(shí)驗(yàn)表明高膽紅素血癥和聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損傷有相關(guān)。活體高膽紅素血癥的動(dòng)物模型目前還不穩(wěn)定，[1-3]本實(shí)驗(yàn)對(duì)體外培養(yǎng)的新生5天小鼠耳蝸組織進(jìn)行藥物處理，模擬新生兒黃疸。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膽紅素濃度為50μmol∕L時(shí)，離體培養(yǎng)的耳蝸組織的神經(jīng)纖維有明顯減少，而內(nèi)外毛細(xì)胞形態(tài)完整，數(shù)量無(wú)明顯變化[11]。本文通過(guò)改變膽紅素濃度，觀察這一現(xiàn)象是否有變化。本實(shí)驗(yàn)觀察到，在25μmol∕L的膽紅素濃度下，膽紅素對(duì)于離體培養(yǎng)的新生小鼠耳蝸組織的神經(jīng)纖維造成毒性損害，并且隨著膽紅素濃度的升高，神經(jīng)纖維的毒性損害逐步加重；而在100μmol∕L膽紅素濃度內(nèi)，膽紅素對(duì)于離體培養(yǎng)的新生小鼠耳蝸組織的內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞幾乎不造成損害。這一點(diǎn)與臨床上觀察到的有關(guān)聽(tīng)神經(jīng)?。ˋNSD）的臨床特點(diǎn)相符合。神經(jīng)元暴露于膽紅素，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加，神經(jīng)元的復(fù)制減少和谷氨酸突觸前神經(jīng)元退行性變[5,12,13]。當(dāng)暴露于膽紅素時(shí)，神經(jīng)支持細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生炎性標(biāo)記物，從而增加細(xì)胞膜和血腦屏障的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的膽紅素負(fù)荷增加[14,15]。過(guò)量的膽紅素能引起細(xì)胞內(nèi)的生物大分子破壞增加。隨著蛋白質(zhì)等大分子的破環(huán)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)腫脹變形和功能障礙，從而導(dǎo)致細(xì)胞破裂和凋亡增加。在正常人和動(dòng)物體內(nèi)，耳蝸是一個(gè)相對(duì)密閉的結(jié)構(gòu)，膽紅素進(jìn)入耳蝸的過(guò)程會(huì)受到各種途徑的限制，所以在體外條件下觀察到的膽紅素與耳蝸組織直接接觸所引起的毒性損傷，與活體的膽紅素對(duì)耳蝸組織的毒性作用存在差異，需要進(jìn)一步的活體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。可能隨著膽紅素濃度的進(jìn)一步增高及時(shí)間延長(zhǎng)，內(nèi)外毛細(xì)胞也會(huì)發(fā)生變化，這也需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表1神經(jīng)纖維Table 1 Nerve fibre

表2內(nèi)毛細(xì)胞Table 2 Inner hair cell

表3外毛細(xì)胞Table 3 Outer hair cell