循環(huán)腫瘤DNA檢測在結(jié)直腸癌臨床診療中的研究進展

王田尹純郭旭邢金良邢延芳

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤中發(fā)病率居第三位，死亡率居第五位［1]。高效的早期篩查方法、準確的動態(tài)評估策略對提高結(jié)直腸癌患者治療效果，延長生存期具有關(guān)鍵作用。目前臨床中常使用糞便潛血檢查、CEA等生物標志物及影像學(xué)手段進行結(jié)直腸癌診斷及監(jiān)測，但難以滿足結(jié)直腸癌防診治全方位的需求，亟待尋找更理想的檢測方法。

近年來，高通量測序技術(shù)迅速發(fā)展，其提供了從分子水平全面認識結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的技術(shù)基礎(chǔ)。已有大量基于組織水平的結(jié)直腸癌分子圖譜研究，但臨床組織樣本需經(jīng)過有創(chuàng)操作才可獲得，難以實現(xiàn)動態(tài)監(jiān)測。液體活檢是近年來新出現(xiàn)的一種技術(shù)，通過在體液樣本中檢測循環(huán)腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）等對腫瘤進行監(jiān)測分析。與組織活檢相比，液體活檢具有微創(chuàng)、簡便快捷和克服瘤內(nèi)異質(zhì)性的優(yōu)勢。ctDNA作為液體活檢的首選，是由腫瘤細胞凋亡、壞死或分泌而釋放入外周血的游離DNA，攜帶了腫瘤細胞的基因變異特征［2]。已有研究證實結(jié)直腸癌患者ctDNA的突變特征與腫瘤組織DNA具有較高一致性［3]。因此，ctDNA檢測可能取代組織DNA檢測，在結(jié)直腸癌的精準醫(yī)療領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

1 二代測序技術(shù)在ctDNA檢測中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的檢測方法如Sanger測序和定量PCR對ctDNA檢測的靈敏度非常低，數(shù)字PCR和BEAMing（beads，emulsion，amplification，magnetics）技術(shù)能夠檢測ctDNA中突變頻率低至0.01%的已知突變。與之相比，二代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)可以檢測所有的癌癥突變并鑒定罕見的基因變異，實現(xiàn)檢出0.0001%的低頻突變。

NGS是基于邊合成邊測序原理，可一次性對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定的檢測技術(shù)。其中，腫瘤個性化深度測序（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-seq）是一種基于捕獲測序的ctDNA檢測方法。該技術(shù)將優(yōu)化的文庫制備方案與多階段生物信息學(xué)方法相結(jié)合，設(shè)計了一個由生物素化DNA寡核苷酸組成的“篩選器”而靶向檢測腫瘤中的常見突變，可檢測到突變頻率低至0.02%的ctDNA，特異性高達96%［4]。另外，通過引入集成數(shù)字錯誤抑制（integrated digital error suppression，iDES），CAPP-seq 檢出 ctDNA的突變頻率可降低至0.004%［5]。選擇性安全測序系統(tǒng)（safe-sequencing system，SAFE-seq）在 PCR擴增前將唯一標識符（unique identifier，UID）分配到每個 DNA片段上，最終只有在同一個UID家族中＞95%的PCR片段存在突變時才被認為是突變，可以有效排除擴增過程產(chǎn)生的誤差，可檢測突變頻率低至0.0001%的突變。但是，其測序周期相對較長，DNA不完全擴增仍可造成假陽性結(jié)果［6]。此外，標記擴增深度測序（targeted error correction sequencing，TEC-seq）是一種基于雙標記條形碼技術(shù)，在基因組多個區(qū)域靶向捕獲的深度測序方法，其檢測特異性高達99.9%，靈敏度可達97.4%。與iDES相比，其假陽性率低于 3×10-7［7]。除了 Illumina平臺，基于半導(dǎo)體的靶向離子流測序（ion semiconductor sequencing）也是一種常見的二代測序技術(shù)，可用于ctDNA檢測［8]。

近年來，隨著DNA檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，ctDNA的相關(guān)研究受到越來越多關(guān)注。二代測序技術(shù)以其高通量、低成本的優(yōu)勢，使通過檢測ctDNA指導(dǎo)腫瘤臨床診療變得更加切實可行。然而，最新發(fā)表在JAMA Oncology雜志的一篇文章指出，相同樣品在不同檢測公司的ctDNA檢測結(jié)果一致性僅為35%左右［9]。針對這些不足，基于ctDNA進一步開發(fā)簡單快速、通量高、成本低、靈敏度和特異性更高的檢測技術(shù)成為當前研究的熱點及難點。

2 ctDNA在結(jié)直腸癌患者中的應(yīng)用

2.1 ctDNA在結(jié)直腸癌患者早期篩查中的應(yīng)用

ctDNA在腫瘤發(fā)生時可以釋放到外周血，因此在早期篩查方面具有良好的應(yīng)用基礎(chǔ)。KOPRESKI等［10]檢測了240例結(jié)直腸癌高危人群的血漿ctDNA，存在Kras突變的64例中有25例確診為結(jié)直腸癌，而無Kras突變的176例中僅有5例最終確診為結(jié)直腸癌，證明了ctDNA中Kras突變可用于評估人群中結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險。CHURCH等［11]研究發(fā)現(xiàn)ctDNA中SEPT9甲基化檢測用于篩查結(jié)直腸癌的靈敏度為48.2%，特異性高達91.5%。此外，有學(xué)者［12]發(fā)明了一種全新的血液檢測技術(shù)——Cancer SEEK，該技術(shù)可檢測血液中與癌癥相關(guān)的DNA和蛋白質(zhì)。該研究在1 005例被臨床確診的8種常見癌癥（包括結(jié)直腸癌）患者中，發(fā)現(xiàn)Cancer SEEK診斷的靈敏度高達70%，特異度超過99%，提示ctDNA與傳統(tǒng)血清蛋白標志物聯(lián)合檢測可以顯著提高結(jié)直腸癌的檢出率和準確性。盡管基于ctDNA的結(jié)直腸癌早期篩查策略具有良好的應(yīng)用前景，但由于腫瘤早期階段的ctDNA含量較低，對檢測技術(shù)要求高［13]。因此，使用ctDNA檢測作為臨床結(jié)直腸癌早期篩查指標仍需進一步探索。

2.2 ctDNA在結(jié)直腸癌患者動態(tài)監(jiān)測及預(yù)后評估中的應(yīng)用

目前，多項研究發(fā)現(xiàn)監(jiān)測ctDNA水平有助于判斷腫瘤負荷，進而指導(dǎo)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評估及臨床治療決策。TIE等［14]檢測230例Ⅱ期結(jié)腸癌患者1 046份血漿標本中的ctDNA，術(shù)后4～10周血漿可檢出腫瘤特異性突變的14例患者中有11例復(fù)發(fā)，164例未檢出的患者中僅16例復(fù)發(fā)，說明結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險與術(shù)后ctDNA的檢出顯著相關(guān)。有文獻報道結(jié)直腸癌中ctDNA監(jiān)測較CEA發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)提前了6.5個月［15]。此外，對于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，ctDNA檢測可以預(yù)測患者的遠期預(yù)后。有研究入組了108例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，血漿中ctDNA水平低于25%百分位數(shù)的患者疾病控制率為77%，而高于75%百分位數(shù)的患者疾病控制率為30%，證明ctDNA定量可以較好地反映轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的預(yù)后［16]。一項納入1 076例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的Meta分析顯示，較高的ctDNA水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)（HR=2.01，P＜1×10-4）［17]。以上研究表明，ctDNA的動態(tài)監(jiān)測有助于實時判斷腫瘤進展，同時具有較好的預(yù)后評估價值。通過檢測ctDNA可對接受治療的患者進一步分類，篩選復(fù)發(fā)風(fēng)險高或預(yù)后較差的患者，以便及時選擇更有效的治療方案。

2.3 ctDNA在結(jié)直腸癌患者治療選擇及耐藥中的應(yīng)用

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因相關(guān)、多階段進展的過程，通過有效抑制或阻斷結(jié)直腸癌的重要驅(qū)動基因可以實現(xiàn)延長患者生存期的目的。靶向治療是結(jié)直腸癌的重要治療方式，然而耐藥機制的多樣性導(dǎo)致其效果存在較大差異［18]。對于耐藥位點突變狀態(tài)的檢測，血漿樣本的ctDNA可實現(xiàn)靶向治療的全程監(jiān)測，明顯優(yōu)于組織樣本。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種酪氨酸激酶受體，與表皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子α結(jié)合后可影響細胞增殖、凋亡以及周圍血管的形成，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。KRAS、NRAS、MET、ERBB2等基因突變是常見的導(dǎo)致EGFR單克隆抗體發(fā)生耐藥的原因［19]。KIM等［20]通過NGS技術(shù)檢測接受帕尼單抗治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者ctDNA中RAS的突變情況，發(fā)現(xiàn)238例患者中188例在基線時為野生型RAS，另外50例是突變型RAS，野生型和突變型RAS患者的中位生存期分別為13.7個月和7.9個月，證實了基線時ctDNA RAS突變型的結(jié)直腸癌患者接受帕尼單抗治療的結(jié)局較RAS野生型差。此外，EGFR信號也由PI3K-Akt通路介導(dǎo)，而PI3K-Akt通路對癌細胞生長和存活至關(guān)重要［21]。XU等［22]對59例西妥昔單抗耐藥的結(jié)直腸癌患者ctDNA進行檢測，發(fā)現(xiàn)PIK3CA突變患者的無進展生存期明顯低于無突變患者，證實PIK3CA突變可能是西妥昔單抗重要的耐藥性位點。另外，在一項基于大隊列結(jié)直腸癌ctDNA的研究發(fā)現(xiàn)，單個患者發(fā)生抗EGFR拮抗劑耐藥可同時存在KRAS、NRAS、MET等多個相關(guān)基因突變［23]。

在過去的20年中，新型靶向藥物的開發(fā)和預(yù)測性標志物的發(fā)現(xiàn)已用于指導(dǎo)患者用藥，使部分轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的生存期明顯延長［24]。然而，受腫瘤異質(zhì)性的限制，結(jié)直腸癌患者選擇治療方案仍較困難。

3 總結(jié)與展望

目前，大量研究表明ctDNA作為潛在生物標志物可用于結(jié)直腸癌的早期篩查、實時監(jiān)測和預(yù)后評估等。國內(nèi)外已有成熟的ctDNA檢測試劑盒且被廣泛接受。2016年Septin9甲基化檢測篩查結(jié)直腸癌和基于EGFR基因突變的液態(tài)活檢方法——羅氏Cobas EGFR突變檢測等液體活檢產(chǎn)品獲得美國FDA批準。2018年2月我國首個液體活檢產(chǎn)品——Super-ARMS EGFR基因突變檢測試劑盒也通過了CFDA審批。然而，ctDNA在結(jié)直腸癌臨床實踐中的應(yīng)用價值仍需在大規(guī)模的前瞻性試驗中進一步驗證。

綜上所述，ctDNA的應(yīng)用對全面認識結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展提供了重要的支持，隨著測序技術(shù)的進步和對其臨床價值的進一步探索，ctDNA終將會在臨床實踐中廣泛應(yīng)用，成為結(jié)直腸癌精準醫(yī)療的重要組成部分。