單環(huán)刺螠糖胺聚糖抗大鼠血小板聚集效應研究

苗 飛，趙紫越，崔青曼，袁春營

天津市海洋環(huán)境保護與修復技術工程中心 天津市海洋資源與化學重點試驗室 天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津 300457

血栓性疾病嚴重威脅人類的生命健康，其發(fā)病率高居各種疾病之首，且近年來還有漸增之勢，為當代醫(yī)學研究的重點和熱點之一，通過血栓形成機制來研究新的抗血栓藥物顯得極為重要[1]。血小板是從骨髓成熟的巨核細胞胞質(zhì)裂解脫落下來的小塊胞質(zhì)，主要生理功能是參與止血與血栓形成。血小板聚集不僅會促進血栓形成，同時也釋放促炎細胞因子，刺激白細胞募集到內(nèi)皮細胞，加重炎性反應。因此，抗血小板活化與聚集藥物的研究已成為血栓性疾病研究領域的熱點，對于新藥開發(fā)與血栓相關疾病的防治具有重要意義[2]。糖胺聚糖是蛋白聚糖大分子中聚糖部分的總稱，由糖胺的二糖重復單位組成，二糖單位中通常有一個是含氨基的糖，另一個是糖醛酸，并且糖基的羥基常常被硫酸酯化，具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、降血糖等廣泛的生物學功能[3-6]。前期研究表明，單環(huán)刺螠糖胺聚糖具有良好的抗氧化作用和很強的抗凝血作用[7-9]。在此基礎上，我們探討了糖胺聚糖抑制大鼠血小板聚集的效應，旨在豐富血小板研究的基礎資料，為該糖胺聚糖的進一步利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SD大鼠30只，體重250±20 g，雌雄各半，SPF級，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，SCXK-(軍)2012-0004。

1.1.2 主要藥品與試劑

單環(huán)刺螠糖胺聚糖，由天津科技大學海洋生物活性物質(zhì)利用研究室分離純化，純度97.32%，硫酸根含量為30.26%，糖醛酸含量為25.25%，氨基糖含量為7.58%；奧扎格雷鈉，國藥準字：H20052521，石家莊四藥有限公司；大鼠血小板血栓素B2(TXB2)、大鼠血小板環(huán)腺苷酸(cAMP)、6-酮-前列腺素(6-keto-PGF1α)酶聯(lián)吸附免疫試劑盒，南京建成生物工程研究所，大鼠血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)，上海語純生物科技有限公司；鈣熒光探針Fluo-4,AM和Fura-2,AM，Sigma公司。

1.1.3 主要儀器

Infinite 200 Pro多功能酶標儀(Tecan公司，瑞士)；Allegra X-15R臺式冷凍離心機(Beckman Coulter公司，美國)；PAM-3型雙通道血小板聚集儀(江蘇丹陽無線電廠，中國)；RF-5301熒光分光光度計(Shimadzu公司，日本)；FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2 實驗方法

SD大鼠隨機分為對照組、陽性對照組(奧扎格雷鈉)和糖胺聚糖組，每組10只。尾靜脈分別注射生理鹽水、奧扎格雷鈉(4 mg/kg)和糖胺聚糖(8 mg/kg)各0.5 mL。制備富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)，測定血小板最大聚集率。

1.2.1 富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)制備

尾靜脈給藥30 min后股動脈采血，以3.8%枸櫞酸鈉抗凝(全血與抗凝劑比例為9∶1)，1 500 rpm離心5 min，制備富血小板血漿(PRP)，4 000 rpm離心10 min制備貧血小板血漿(PPP)。

1.2.2 血小板聚集率測定

用PPP調(diào)PRP(血小板數(shù)為5×109/mL)，以二磷酸腺苷作為誘導劑(終濃度為1 μmol/L)，孵育5 min，PAM-3型雙通道血小板聚集儀進行血小板聚集試驗，描記聚集曲線，計算血小板最大聚集百分率。

1.2.3 血小板環(huán)磷酸腺苷的測定

用PPP調(diào)PRP(血小板數(shù)為1×109/mL)，取血小板懸液200 μL置于塑料離心管中，加入二磷酸腺苷作為誘導劑(終濃度為1 μmol/L)，加入ENZO試劑盒提供的0.1 mol/L 鹽酸(200 μL)處理，液氮37 ℃反復凍融5次。室溫離心(4 000 rpm，10 min)，吸取100 μL 上清液，按照試劑盒說明書測定血小板cAMP濃度。

1.2.4 雙波長Fura-2熒光分光光度法測定大鼠血小板內(nèi)鈣離子濃度

參照文獻[10]并略加修改。血小板懸液與5 μmol/L Fura-2,AM 混勻，37 ℃水浴避光孵育40 min，立即離心，棄上清，沉淀以無Ca2+的Hepes緩沖液洗兩次，再用無Ca2+的Hepes緩沖液重新懸浮。負載后的血小板懸液中加入CaCl2溶液(終濃度1 mmol/L)孵育10 min，調(diào)整血小板數(shù)為5×109/mL，用二磷酸腺苷刺激5 min，進行熒光測定。

激發(fā)波長分別固定在340 nm、380 nm，波寬5 nm，發(fā)射波長固定在510 nm，波寬5 nm，記錄Fura-2在激發(fā)波長340 nm、380 nm處測得的熒光強度比值(F340/F380)，然后加入20 μL 20%的TritonX-100，測定Rmax，再加入20 μL 0.5 mmol/L的乙二醇雙(2-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)，測定Rmin，根據(jù)比值法公式計算出血小板內(nèi)[Ca2+]i濃度。

式中Kd為Fura-2/AM與Ca2+反應的解離常數(shù)，為224 nmol/L，R為各測定點F340對F380熒光強度的比值。Rmax為加入TritonX-100使得Fura-2和鈣離子結合達飽和時所測得的F340/F380，Rmin為加入高于Ca2+濃度2～3倍的EGTA，使得Fura-2游離，測得的F340/F380。SFB為組成Rmin和Rmax的F380之間的比值。

1.2.5 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測大鼠血小板內(nèi)鈣離子濃度的變化

取制備好的洗滌血小板懸液，加入Fluo-4,AM混勻，使Fluo-4,AM在血小板懸液中的終濃度為5 μmol/L，37 ℃避光孵育60 min，4 000 rpm，離心5 min，棄上清，血小板沉淀以HEPES緩沖液洗兩次，重新懸浮，調(diào)整血小板濃度為4×108/mL，37 ℃復溫10 min，ADP刺激后立即用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 大鼠血漿TXB2和6-keto-PGF1α的測定

富血小板血漿(血小板數(shù)為1×109/mL)，經(jīng)ADP刺激后，離心(4 000 rpm，10 min)，分離上清血漿，按照試劑盒說明書測定TXB2和6-keto-PGF1α濃度。

1.2.7 大鼠血小板GPⅡb/Ⅲa濃度的測定

富血小板血漿(血小板數(shù)為1×109/mL)，經(jīng)ADP刺激后，離心(4 000 rpm，10 min)，將下層血小板沉淀凍融裂解，10 000 rpm離心5 min，取上層清液用ELISA試劑盒測定GPⅡb/Ⅲa濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 糖胺聚糖對大鼠血小板聚集率的影響

以大鼠為實驗材料，生理鹽水為空白對照，奧扎格雷鈉為陽性對照，進行糖胺聚糖的抗血小板聚集率測定，結果見表1，從表1看出，與對照組相比，糖胺聚糖組大鼠的血小板最大聚集百分率顯著減小(P<0.01)，說明該糖胺聚糖具有明顯的抗大鼠血小板聚集作用，陽性對照藥物奧扎格雷鈉顯著降低大鼠血小板最大聚集百分率(P<0.01)，但與糖胺聚糖組相比，沒有顯著性差異(P>0.05)。

組別Groups血小板聚集率Platelet aggregation rate(%)對照組Control55.57±7.76奧扎格雷鈉Ozagrel sodium39.87±5.57??糖胺聚糖Glycosaminoglycan42.84±4.82??

注：與對照組比較，**P<0.01。
Note:Comparison with the control group,**P<0.01.

2.2 糖胺聚糖對大鼠血小板cAMP濃度的影響

大鼠血小板cAMP濃度測定結果見圖1，與對照組相比，單環(huán)刺螠糖胺聚糖和奧扎格雷鈉均能夠顯著升高大鼠血小板cAMP的濃度(P<0.01)，陽性藥物的作用程度稍高于糖胺聚糖，但沒有達到顯著性差異(P>0.05)。推測該糖胺聚糖可能通過升高血小板內(nèi)cAMP含量而起到抑制血小板活化的作用，從而抑制ADP誘導的血小板聚集。

圖1 糖胺聚糖對大鼠血小板cAMP濃度的影響Fig.1 Effect of glycosaminoglycan on the cAMP concentration in rat platelets注：與對照組比較，**P<0.01。Note:Comparison with the control group,**P<0.01.

2.3 糖胺聚糖對大鼠血小板內(nèi)鈣離子濃度的影響

結果見圖2。從圖2可以看出，糖胺聚糖和陽性藥物均能顯著降低血小板內(nèi)的鈣離子濃度(P<0.01)，與陽性藥物相比較，糖胺聚糖降低血小板鈣離子濃度的程度略高。推測糖胺聚糖可能通過促進大鼠血小板鈣池內(nèi)鈣離子的釋放和鈣離子內(nèi)流，起到抗血小板聚集的作用。

圖2 糖胺聚糖對大鼠血小板內(nèi)鈣離子濃度的影響Fig.2 The effect of glycosaminoglycan on the concentration of calcium ion in the rat platelets

2.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察

Fluo-4,AM是一種新型的鈣離子熒光探針，穿透細胞膜進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-4，與細胞內(nèi)鈣離子結合后可以產(chǎn)生較強的熒光，最大激發(fā)波長為494 nm，最大發(fā)射波長為516 nm，根據(jù)其熒光強度即可測出血小板內(nèi)[Ca2+]i濃度的變化。血小板負載鈣離子探針fluo-4,AM后，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，結果見圖3。從圖3可以看出，對照組熒光強度很強，說明血小板內(nèi)鈣離子濃度高，奧扎格雷鈉組熒光強度遠低于對照組，但高于糖胺聚糖組，說明三個處理組血小板內(nèi)鈣離子濃度的順序是：對照組>奧扎格雷鈉組>糖胺聚糖組，與2.3的結果一致。

圖3 大鼠血小板的激光掃描共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig.3 The laser scanning confocal microscope photo of rat platelets

2.5 糖胺聚糖對大鼠血漿TXB2和6-keto-PGF1α濃度的影響

大鼠血漿TXB2和6-keto-PGF1α濃度的測定結果見表2。糖胺聚糖和奧扎格雷鈉均能夠顯著降低血漿中的TXB2濃度(P<0.05，P<0.01)，且奧扎格雷鈉降低血漿中的TXB2濃度的程度高于糖胺聚糖，但未達顯著性水平(P>0.05)；糖胺聚糖和奧扎格雷鈉均能夠顯著升高血漿中的6酮前列腺素F1α濃度(P<0.01)，然而糖胺聚糖的作用程度略高于奧扎格雷鈉，但未達顯著水平(P>0.05)。

表2 糖胺聚糖對大鼠血漿TXB2和6-keto-PGF1α濃度的影響Table 2 Effect of glycosaminoglycan on the concentrations of TXB2 and 6-keto-PGF1α in rats

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。
Note:Comparison with the control group,*P<0.05，**P<0.01.

圖4 糖胺聚糖對大鼠血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa濃度的影響Fig.4 Effect of glycosaminoglycan on the concentration of membrane glycoprotein GPIIb/IIIa in rat platelets

2.6 糖胺聚糖對大鼠血小板糖膜蛋白GPⅡb/Ⅲa濃度的影響

研究證實，血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原等黏附蛋白結合是多種因素引起血小板聚集的不可缺少的最終共同途徑[11]，所以測定大鼠血小板上的膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa具有重要意義。本研究的測定結果見圖4，由圖4看出，奧扎格雷鈉和糖胺聚糖均能夠顯著降低大鼠血小板糖膜蛋白GPⅡb/Ⅲa的濃度(P<0.05，P<0.01)，且奧扎格雷鈉降低糖膜蛋白GPⅡb/Ⅲa濃度的程度高于糖胺聚糖，但未達顯著性水平(P>0.05)。

3 討論

血小板在血管損傷部位的血栓形成中發(fā)揮重要作用，尤其是動脈和微血栓形成，是心腦血管疾病的主要原因[12]。血小板聚集是一個復雜的過程，它的激活主要是通過血小板粘附于損傷部位介導的，此外，內(nèi)源性激動劑如ADP、膠原、凝血酶的作用和作為放大因子的TXA2釋放等加速這一過程，這些激動劑通過血小板膜上的特異性受體促進血小板聚集[13]。

血小板內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是細胞內(nèi)信號傳遞的第二信使，血小板聚集功能受到血小板內(nèi)的cAMP含量調(diào)節(jié)，當cAMP含量增加，可以激活蛋白激酶，使蛋白磷酸化，興奮鈣泵并抑制Ca2+從儲庫中釋放，從而抑制血小板的聚集[14]；鈣離子在血小板活化過程中起到了關鍵作用，血小板的變形、聚集、釋放反應都可由血小板胞漿游離鈣離子濃度增高觸發(fā)，血小板胞漿游離鈣離子濃度的增高是血小板參與血栓形成的重要機制之一[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠糖胺聚糖能夠降低大鼠血小板內(nèi)鈣離子濃度，顯著升高血小板cAMP濃度，從而抑制ADP誘導的血小板聚集，顯著降低大鼠血小板聚集百分率。

TXA2在血小板內(nèi)血栓素合成酶的催化下生成，具有很強的聚集血小板與縮血管作用，是目前已發(fā)現(xiàn)的最強的縮血管物質(zhì)與血小板聚集劑之一；PGI2主要在血管壁內(nèi)皮細胞生成，是較強的血小板聚集抑制劑，具有抑制血小板的黏附、聚集和釋放反應，抑制血小板的促凝活性等作用，TXA2和PGI2之間的動態(tài)平衡是維持機體出凝血功能的基礎[16]。由于TXA2和PGI2不穩(wěn)定，因此常將TXA2和PGI2穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2和6-keto-PGF1α作為判斷其濃度的指標[17,18]。血小板膜糖蛋白在血小板黏附聚集和釋放反應中起著重要作用，當血小板受刺激活化時，血小板膜糖蛋白發(fā)生改變，GPⅡb/Ⅲa可直接反映血小板活化的狀態(tài)，其分子數(shù)量增高成為血小板黏附性增高的重要原因，血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa與血栓性疾病尤其是心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關系[19]。本研究表明，單環(huán)刺螠糖胺聚糖能夠顯著降低大鼠血漿TXB2含量，顯著升高6-keto-PGF1α含量(P<0.01)，顯著降低血小板膜糖蛋白的濃度(P<0.05)，表明該糖胺聚糖可能通過抑制血小板釋放血栓素和促進血管內(nèi)皮釋放前列環(huán)素來實現(xiàn)對血小板聚集的抑制作用。關于單環(huán)刺螠糖胺聚糖抑制大鼠血小板聚集的分子機制有待進一步研究。