重樓法定基原與其同屬近緣種的多重PCR鑒別體系研究

張開(kāi)元，饒文霞，尹顯梅，陳 蓉，崔 欣，唐 卓*，尹鴻翔

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137，2中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所天然產(chǎn)物中心，成都 610041； 3成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，成都 611137

中藥重樓，來(lái)自百合科(Liliaceae)重樓屬(ParisL.)多年生草本植物。其中，七葉一枝花(ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara)與云南重樓(P.polyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)的干燥根莖被歷版《中國(guó)藥典》作為正品收載。重樓藥用歷史悠久，以“蚤休”之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚之功效，可用于疔瘡癰腫，咽喉腫痛，蛇蟲(chóng)咬傷，跌撲傷痛，驚風(fēng)抽搐的治療[1]，是很多著名中成藥如云南白藥、宮血寧膠囊、抗病毒顆粒等的重要原料。

經(jīng)過(guò)課題組前期對(duì)我國(guó)西南地區(qū)重樓人工種植基地的考察發(fā)現(xiàn)，由于重樓栽培正處于野生變家種的階段，種苗的生產(chǎn)和貿(mào)易缺乏行業(yè)規(guī)范，來(lái)源混亂，人工栽培品種除七葉一枝花(P.polyphyllavar.chinensis)與云南重樓(P.polyphyllavar.yunnanensis)之外，還包括多葉重樓(P.polyphyllavar.polyphylla)，狹葉重樓(P.polyphyllavar.stenophylla)，南重樓(P.vietnamensis)，五指蓮(P.axialisvar.axialis)，平伐重樓(P.vaniotii)，球藥隔重樓(P.fargesii)，黑籽重樓(P.thibeticavar.thibetica)，長(zhǎng)柱重樓(P.forrestii)等多個(gè)近緣類群，品種十分混亂。而重樓以根莖入藥，根據(jù)性狀及顯微等特征難以對(duì)正品及其近緣混用種藥材進(jìn)行有效區(qū)分，這給中醫(yī)處方和中成藥的質(zhì)量控制方面帶來(lái)了極大的安全隱患[2]。因此，對(duì)正品重樓及其混用近緣種進(jìn)行有效區(qū)分，在藥材生產(chǎn)和貿(mào)易中建立一種快速、準(zhǔn)確的鑒別方法，對(duì)于重樓的用藥安全、質(zhì)量控制以及重樓屬中瀕危種群的保護(hù)都有著十分重要的意義。

隨著分子生物學(xué)迅速發(fā)展，植物在DNA水平上的多樣性研究取得突破性進(jìn)展，用于藥用植物的分子鑒定技術(shù)也日漸成熟[3]。對(duì)于重樓這一基原復(fù)雜的中藥，商品藥材的真?zhèn)舞b定工作既要實(shí)現(xiàn)藥典法定種和多個(gè)混用種的區(qū)分，又要兼顧2個(gè)藥典法定種的同時(shí)鑒別，另外還要避免云南重樓2個(gè)基因型導(dǎo)致的“假陰性”結(jié)果。然而，僅憑“1對(duì)引物”的普通PCR方法，將會(huì)需要3次PCR才能完成一份樣品的鑒別，顯然效率低、成本高。為了解決這一問(wèn)題，本研究選擇rDNA-ITS作為鑒別序列，并將3對(duì)特異性引物集成到一個(gè)PCR體系中，僅需一次PCR即可實(shí)現(xiàn)上述鑒定效果，從而建立了對(duì)藥典法定重樓基原與其混用近緣種進(jìn)行快速鑒別的多重PCR鑒別體系。

1 材料

1.1 藥材樣品

本次實(shí)驗(yàn)材料包括七葉一枝花34份，云南重樓65份，多葉重樓17份，狹葉重樓10份，南重樓8份，五指蓮重樓5份，平伐重樓7份，球藥隔重樓22份，黑籽重樓13份，長(zhǎng)柱重樓3份。實(shí)驗(yàn)材料樣本采集地等詳細(xì)信息見(jiàn)表1。樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)尹鴻翔副教授鑒定，保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑

瓊脂糖(廣州賽國(guó)生物科技有限公司)，Goldview I型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)，EasyTaq DNA polymerase，10× EasyTaq Buffer(Mg2+plus)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，DNAMarker -B，dNTPs Mixture Solution (生工生物工程股份有限公司)，植物組DNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)，α-高聚淀粉酶(思科生物科技有限公司)。

表1 實(shí)驗(yàn)樣本信息Table 1 Sample information of Paris

續(xù)表1(Continued Tab.1)

樣品名稱Sample name采集地點(diǎn)Source部位Part份數(shù)Sample quantity樣品名稱Sample name采集地點(diǎn)Source部位Part份數(shù)Sample quantity貴州長(zhǎng)順葉2貴州長(zhǎng)順葉2?四川石棉葉1貴州安順葉2?四川彭州葉2貴州六枝葉7?球藥隔重樓(Q)P.fargesii四川崇州葉6四川石棉葉4四川平武葉1四川會(huì)理葉1四川大邑葉1四川大邑葉3?四川彭州葉7四川彭州葉3?江西黃洋界葉1四川彭州葉3湖南雙牌葉2四川鹽源葉、根莖2湖北來(lái)鳳葉、根莖3四川鹽邊葉、根莖2貴州水城葉1云南騰沖葉4黑籽重樓(HZ)P.thibetica var.thibetica四川大邑葉1云南金平葉1?四川平武葉1云南耿馬葉2?四川安縣葉2云南普洱葉2四川北川葉2云南普洱葉2?四川彭州葉2云南宣威葉8四川崇州葉2多葉重樓(DY)P.polyphylla var.polyphylla四川崇州葉1四川峨眉山葉2四川雅安葉1甘肅文縣葉1四川普格葉1長(zhǎng)柱重樓(CZ)P.forrestii云南騰沖葉、根莖3

注：云南重樓樣品有“*”標(biāo)識(shí)的為基因型II，未有標(biāo)識(shí)的為基因型I。
Note:P.polyphyllavar.yunnanensissamples of genotype II were marked with "*",while samples of genotype I were unmarked.

1.3 儀器

Legend Micro 21R 離心機(jī)(美國(guó) Thermo),BSA124S 分析天平(Sartorius科學(xué)儀器有限公司),MK-10干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司),PCR儀(杭州博日科技有限公司),DDY-12電泳系統(tǒng)(北京六一儀器廠),激光成像儀Typhoon 7000(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科技部),微量紫外-分光光度儀(Thermo Nanodrop 2000)。

2 方法

2.1 基因組DNA提取

葉片樣品硅膠干燥，取30 mg，用植物組DNA提取試劑盒提取總DNA。根莖樣品研粉，過(guò)3號(hào)篩，取20 mg粉末，按照植物組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行改進(jìn)，加蛋白酶的同時(shí)添加20 μL的75% α-高聚淀粉酶提取總DNA，-4 ℃保存。DNA提取物用通用引物ITS-4/ITS-L[4]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物取7.5 μL，采用3%的瓊脂糖凝膠電泳成像和微量紫外-分光光度儀驗(yàn)證DNA質(zhì)量。通用引物序列見(jiàn)表2。

2.2 ITS測(cè)序及特異性引物設(shè)計(jì)與篩選

在多重PCR鑒別體系中，多對(duì)特異性引物的設(shè)計(jì)是最為關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)。用通用引物ITS-4/ITS-L對(duì)提取的重樓樣品DNA模板進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，每個(gè)樣品平行擴(kuò)增3次，擴(kuò)增產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。用Megalign軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列校對(duì)與分析，找出具有穩(wěn)定差異的SNP位點(diǎn)，用Pirmer permier 5.0軟件在七葉一枝花和云南重樓的特有SNP位點(diǎn)區(qū)域分別設(shè)計(jì)特異性引物，并用設(shè)計(jì)的引物對(duì)重樓樣品DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出特異性好，能夠準(zhǔn)確區(qū)分兩個(gè)法定品種并能有效鑒別其他常見(jiàn)偽品的引物。

2.3 重樓多重PCR擴(kuò)增體系的建立

PCR反應(yīng)體系總體積25 μL，其中包括10×EasyTaq Buffer 2.5 μL，dNTPs mixture 280 μM，引物對(duì)H-F/H-R用量0.15/0.2 μM，引物對(duì)YN-IF2/YN-IR2用量0.25/0.15 μM，引物對(duì)YN-IIF3/YN-IIR21用量0.2/0.25 μM，EasyTaq DNA polymerase 1.5 U，模板DNA 30 ng，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)充體系至25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物7.5 μL，加6×Loading buffer混勻后，于Goldview I染色的3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，220 V電壓下電泳20 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照保存。

3 結(jié)果

3.1 模板質(zhì)量

采用通用引物ITS對(duì)本實(shí)驗(yàn)所有的模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，均得到約700 bp左右的擴(kuò)增條帶，表明本實(shí)驗(yàn)的模板DNA質(zhì)量符合PCR擴(kuò)增要求。

3.2 法定基原重樓ITS序列的SNP位點(diǎn)分析及引物設(shè)計(jì)

在對(duì)65份不同產(chǎn)地的云南重樓樣本的ITS序列進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)依據(jù)SNP位點(diǎn)可以劃分為2種基因型，二者在SNP上的多樣性表現(xiàn)為40個(gè)位點(diǎn)，分別編號(hào)為：YN-I 和YN-II，基因型具體劃分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3。其中，YN-I型樣本有35份，YN- II型樣本有30份，為了避免漏檢其中之一基因型，出現(xiàn)云南重樓檢測(cè)的假陰性，需要同時(shí)設(shè)計(jì)兩個(gè)引物對(duì)。設(shè)計(jì)并命名鑒別七葉一枝花的特異性引物對(duì)H-F/H-R，鑒別云南重樓基因型I、II的特異性引物對(duì)YN-IF2/YN-IR2，YN-IIF3/YN-IIR21。引物序列由擎科梓熙生物科技有限公司合成。三對(duì)特異性引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列表Table 2 Primers used in this study

表3 云南重樓兩類基因型的SNP位點(diǎn)特征Table 3 SNP site characteristics in two genotypes of P.polyphylla var.yunnanensis

3.3 多重PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

3.3.1 最適引物濃度的考察

設(shè)置三對(duì)特異性引物H-F/H-R，YN-IF2/YN-IR2，YN-IIF3/YN-IIR21的不同濃度比例，見(jiàn)表4?？疾觳煌餄舛葘?duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響，篩選最適引物濃度。通過(guò)調(diào)整引物用量，在保證特異性條帶亮度的同時(shí)削弱非特異性條帶，并綜合考慮節(jié)約引物用量，選擇引物濃度比例E。保證七葉一枝花在210 bp有一條明亮條帶，云南重樓基因型I(YN-I)在248 bp有一條明亮條帶，云南重樓基因型II(YN-II)在149 bp有一條明亮條帶，見(jiàn)圖1。

表4 引物濃度優(yōu)化條件Table 4 Optimal conditions of specific primers’ concentration

圖1 多重PCR體系引物濃度考察電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of primers concentration investigation注：M：DNA Marker，從上至下依次為：600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp；BC為空白對(duì)照，H為七葉一枝花，I為云南重樓(基因型YN-I)，II為云南重樓(基因型YN-II)，NC為近緣種多葉重樓陰性對(duì)照，下同。圖A、B、C、D、E、F中三引物對(duì)濃度比即為文中所述。Note：M：DNA Marker,from top to bottom,the following is:600 bp,500 bp,400 bp,300 bp,200 bp and 100 bp;BC is Blank control,H is P.polyphylla var. chinensis,I is P.polyphylla var.yunnanensis (YN-I),II is P.polyphylla var.yunnanensis (YN-II),NC is P.polyphylla var.polyphylla as the negative control,similarly hereinafter.The concentration of three specific primer pairs in figure A,B,C,D,E and F are as described in the article.

3.3.2 最適dNTP濃度的考察

dNTP濃度分別設(shè)置為120、200、280、400 μM，考察不同dNTP濃度對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響，篩選最適dNTP濃度(圖2)。結(jié)果表明，dNTP隨濃度的增加，對(duì)多重PCR反應(yīng)具有抑制作用。當(dāng)dNTP濃度為120至280 μM時(shí)，可逐漸抑制非特異性條帶的產(chǎn)生；當(dāng)濃度高于280 μM時(shí)，則會(huì)開(kāi)始對(duì)特異性鑒別條帶產(chǎn)生抑制。因此，本研究選擇dNTP濃度為280 μM。

3.3.3 最適Taq酶用量的考察

25μL體系中Taq酶用量分別設(shè)置為0.5、1.5、2.5、3.5 U，考察不同Taq酶用量對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響，篩選最適Taq酶用量(圖3)。結(jié)果表明，0.5至3.5 U的Taq酶均可擴(kuò)增出特異性條帶，當(dāng)用量達(dá)到1.5 U以上時(shí)，三條特異性條帶亮度較高，為了弱化非特異性條帶的擴(kuò)增，本研究選擇Taq酶用量為1.5 U。

圖2 多重PCR體系dNTP濃度考察電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of dNTP concentration investigation注：圖A、B、C、D中dNTP濃度依次為120、200、280、400 μMNote：The concentration of dNTP in figure A,B,C and D are 120,200,280 and 400 μM

圖3 多重PCR體系Taq酶用量考察電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of Taq polymerase dosage investigation注：圖A、B、C、D中Taq酶用量依次為0.5、1.5、2.5、3.5 UNote：The dosage of Taq polymerase in figure A,B,C and D are 0.5,1.5,2.5 and 3.5 U

3.3.4 最適退火溫度的考察

分別設(shè)置退火溫度為60、62.4、64.3、66 ℃，考察不同退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響，篩選最適退火溫度(圖4)。結(jié)果顯示，溫度的升高可提高反應(yīng)的特異性，但當(dāng)退火溫度高達(dá)66 ℃時(shí)，特異性鑒別條帶亮度較弱，YN-I的特異性條帶甚至幾乎無(wú)法擴(kuò)增。因此，綜合考慮退火溫度對(duì)三對(duì)特異性引物擴(kuò)增效率的影響，選擇64 ℃為本體系的退火溫度。

圖4 多重PCR體系退火溫度考察電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of annealing temperature investigation注：圖A、B、C、D中退火溫度依次為60、62.4、64.3、66 ℃Note：The annealing temperature in figure A,B,C and D are 60,62.4,64.3 and 66 ℃

3.3.5 最適循環(huán)數(shù)的考察

分別選用26、27、28、30和32個(gè)循環(huán)進(jìn)行考察，考察不同循環(huán)數(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響，篩選最適擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)(圖5)。結(jié)果表明，26至32循環(huán)時(shí)均能擴(kuò)增出三者的特異性鑒別條帶。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性及避免因循環(huán)數(shù)過(guò)多導(dǎo)致可能的非特異性條帶擴(kuò)增，選擇為27個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)。

圖5 多重PCR體系循環(huán)數(shù)考察電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis of cycles investigation注：圖A、B、C、D、E中循環(huán)數(shù)依次為26、27、28、30、32Note：The cycles in figure A,B,C,D and E are 26,27,28,30 and 32

3.3.6 模板量的考察

對(duì)反應(yīng)體系中模板DNA的用量進(jìn)行了考察，分別設(shè)置10、30、60、90 ng的模板DNA用量(圖6)。結(jié)果表明，模板量在10～90 ng時(shí)均能擴(kuò)增出特異性條帶，且隨著模板DNA的增加，擴(kuò)增條帶的亮度呈遞增趨勢(shì)。

具體優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表5。

圖6 多重PCR體系模板量考察電泳圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of template quantity investigation注：圖A、B、C中樣品分別為H、I、II，每幅圖中模板量依次為10、30、60、90 ngNote：The samples in figure A,B and C are H,I and II.The template quantities in each figure are 10,30,60 and 90 ng

表5 多重PCR體系的優(yōu)化Table 5 Optimization of multiplex PCR identification system

續(xù)表5(Continued Tab.5)

優(yōu)化因素Optimization factors條件ConditionsHYN-IYN-IINC模板量Template quantity (ng)10+++-30+++-60+++-90+++-

注：“+”一條亮帶，“△”一條暗帶，“-”無(wú)條帶。
Note:“+” one bright band,”△” one dark band,”-” no band.

3.4 多重PCR特異性鑒別結(jié)果

采用上述所確定的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，用法定基原種及8種常見(jiàn)的同屬近緣人工栽培品種對(duì)所建立的多重PCR鑒別體系進(jìn)行方法適用性驗(yàn)證(圖7)。結(jié)果顯示七葉一枝花樣本可擴(kuò)增出片段大小為210 bp的特異性片段，云南重樓種下的兩類基因型(YN-I 、YN-II)樣本可分別擴(kuò)增出248 bp和149 bp的特異性片段，同時(shí)得到了陽(yáng)性鑒定，而其他同屬近緣種無(wú)任何片段，避免了干擾，易于直觀、準(zhǔn)確的鑒別。

圖7 法定基原種及其常見(jiàn)的8種同屬近緣人工栽培種的多重PCR鑒別電泳圖Fig.7 Agarose gel electrophoresis of legal origins and their 8 closely related species from cultivated investigation注：M：DNA Marker，BC為空白對(duì)照，H為七葉一枝花，I為云南重樓(YN-I)，II為云南重樓(YN-II)，DY為多葉重樓，XY為狹葉重樓，N為南重樓，WZL為五指蓮，PF為平伐重樓，Q為球藥隔重樓，HZ為黑籽重樓，CZ為長(zhǎng)柱重樓。Note：M:DNA Marker,BC is Blank control,H is P.polyphylla var. chinensis,I is P.polyphylla var.yunnanensis (YN-I),II is P.polyphylla var.yunnanensis (YN-II),DY is P.polyphylla var.polyphylla,XY is P.polyphylla var.stenophylla,N is P.vietnamensis,WZL is P.axialis var. axialis,PF is P.vaniotii,Q is P.fargesii,HZ is P.thibetica var.thibetica,CZ is P.forrestii.

4 討論

在多重PCR技術(shù)的適用性方面，該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)在單個(gè)反應(yīng)管中一次性檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)的目的，相比普通PCR單個(gè)反應(yīng)管中只能通過(guò)一對(duì)特異性引物檢測(cè)單個(gè)靶標(biāo)的反應(yīng)更加高效、經(jīng)濟(jì)、快捷，在農(nóng)作物[5-7]、動(dòng)物[8,9]、微生物[10,11]和腫瘤細(xì)胞[12,13]等的鑒別中應(yīng)用廣泛，也逐漸應(yīng)用到金錢(qián)白花蛇[14]、人參、西洋參、三七[15,16]等中藥材的鑒別中。在靶序列的選擇方面，朱英杰[17]等用6種DNA 條形碼候選序列對(duì)重樓屬11個(gè)物種不同序列的鑒定能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)ITS2序列與其他 DNA 條形碼候選序列相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。姜黎[4]等對(duì)重樓屬8個(gè)物種4條DNA條形碼候選序列進(jìn)行考察，認(rèn)為ITS序列能夠鑒定重樓與其常見(jiàn)近緣種及飲片，顯示ITS序列適宜作為重樓屬下鑒定的靶序列。

在對(duì)65份云南重樓樣品進(jìn)行測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)，云南重樓序列的種內(nèi)差異較大，根據(jù)ITS序列的SNP可分為兩種類型。這也符合陳士林[18]《中藥DNA條形碼分子鑒定》中對(duì)4條長(zhǎng)度為231bp的云南重樓DNA條形碼ITS2參考序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)有27個(gè)變異位點(diǎn)的表述。因此，本研究首次提出云南重樓應(yīng)該區(qū)分為兩類基因型：YN-I和YN-II，為了兼顧兩類基因型的云南重樓藥材的鑒別，避免假陰性結(jié)果，分別對(duì)兩類基因型的云南重樓設(shè)計(jì)特異性引物。

建立多重PCR擴(kuò)增體系，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，尤其是同屬近緣種之間變異位點(diǎn)少，保證引物的特異性及引物之間相互不干擾是鑒別成功的關(guān)鍵[19]。本研究的引物的設(shè)計(jì)將針對(duì)重樓的法定基原七葉一枝花及兩種基因型的云南重樓分別設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物。為了保證引物特異性，本研究把引物YN-IIR21的5′端第八位和第十二位引入了錯(cuò)配，將原本的核苷酸G和T突變?yōu)楹塑账酺和A，把引物H-F的3′端第二位的核苷酸G突變?yōu)锳，把引物H-R的3′端第二位的核苷酸T突變?yōu)锳，并且所有特異性引物的Tm值相差在4以內(nèi)，以保證擴(kuò)增效率一致。另外，相對(duì)于單一引物對(duì)PCR體系，在建立多重PCR擴(kuò)增體系時(shí)，不同引物對(duì)的濃度比是影響多重PCR 特異性和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，引物對(duì)之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)和互配關(guān)系，適宜的濃度比是多重PCR體系能穩(wěn)定擴(kuò)增的關(guān)鍵因素[20]。在多基原中藥品種重樓同屬近緣種繁多的情況下，確定多重引物的濃度是本研究成功的重點(diǎn)及難點(diǎn)，本方法是經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)和條件優(yōu)化而確定最佳反應(yīng)體系。

為了保證樣品基原的正確，本實(shí)驗(yàn)在原植物形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)之上，對(duì)各樣本ITS序列的單一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收測(cè)序，并進(jìn)行Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)同源性比對(duì)分析，從而保證了樣品基原的準(zhǔn)確性，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性奠定了基礎(chǔ)。

同屬近緣種的混用情況一直是影響中藥材質(zhì)量的一個(gè)重要因素，由于其外觀性狀及顯微結(jié)構(gòu)相似，化學(xué)成分交叉重疊，導(dǎo)致鑒定困難[19]，重樓作為典型的“同屬多基原”品種更是如此。本實(shí)驗(yàn)首次建立了重樓藥典法定基原與其同屬近緣種的多重PCR鑒別體系，該方法特異性高，適用性強(qiáng)，只通過(guò)一次PCR擴(kuò)增即可準(zhǔn)確、快速、可靠地鑒別七葉一枝花和云南重樓這兩種藥典法定重樓基原，并且能兼顧兩類基因型云南重樓藥材，避免假陰性，在重樓藥材和飲片的真?zhèn)舞b別，重樓人工栽培的種子種苗質(zhì)量控制中值得推廣和應(yīng)用。