尾葉香茶菜不同部位揮發(fā)性成分比較分析

楊 翠，趙錦花，王 強，楊衛(wèi)雪，李光開，扈雅寧

1長春師范大學化學學院，長春 130032； 2長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，延吉 133002

尾葉香茶菜Rabdosiaexcisa(Maxim.) Hera為唇形科香茶菜屬植物，屬于多年生草本植物，廣泛分布黑龍江、吉林及遼寧等省區(qū)[1,2]。主要生長于草叢、林中、林緣等陰生地帶。尾葉香茶菜全草入藥，性味苦涼，具有清熱解毒、健脾、活血等功效[3]。在民間，尾葉香茶菜被用于治療風濕感冒、喉嚨腫痛、關節(jié)疼痛、蛇蟲咬傷等[4]。

目前，關于尾葉香茶菜的研究重點聚焦于水或醇提取物化學成分分離及藥理活性研究，且多為全草[5]。在中草藥開發(fā)中，尾葉香茶菜作為藥用植物的一員，在抗癌、抗腫瘤等研究中的價值越來越受到科研人員的關注。目前關于尾葉香茶菜揮發(fā)性成分的研究報道很少，且重點聚焦于尾葉香茶菜揮發(fā)性成分的定性分析[6-8]，及活性探究，并發(fā)現(xiàn)了揮發(fā)性成分具有降低血液中膽固醇濃度[7]、抑菌、抗氧化活性[8]等作用。關于尾葉香茶菜不同部位揮發(fā)性成分比較的相關研究未見報道，且尾葉香茶菜中已定性揮發(fā)性成分非常有限。為此，本研究采用氣流吹掃微萃取方法與GC-MS聯(lián)用對尾葉香茶菜揮發(fā)性成分開展系統(tǒng)性研究，利用化學方法和統(tǒng)計學方法(主成分分析)比較其不同部位(根、莖、葉)揮發(fā)性成分的差異，為尾葉香茶菜的進一步開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(島津，日本，GC-MS plus 2010)，100 μL襯管(安捷倫，美國)，AS20500AH型超聲波清洗器(天津AU-TOSCIENCE公司)，F(xiàn)W-100高速萬能粉碎機(天津泰斯特)，進樣墊(島津，日本)，聚四氟乙烯管等。色譜純正己烷(Fisher，美國)。

1.2 材料

尾葉香茶菜于2016年8月采自吉林省長白山，將根、莖、葉分別剪切、洗凈后置于陰涼通風處在自然條件下陰干。干燥的尾葉香茶菜用粉碎機粉碎，過200目篩，置于棕色樣品瓶中，-20 °C貯存?zhèn)溆谩?/p>

2 實驗方法

2.1 揮發(fā)性成分的萃取

依據(jù)先前報道[9-11]，操作步驟如下：①準確稱取粉碎的尾葉香茶菜植物樣品5.0 mg，放入樣品槽中，并安裝儀器；②取50 μL正己烷置于100 μL襯管(接收器)中；③打開開關開始萃??；④萃取后，利用正己烷定容至100 μL，隨后取2 μL進樣分析。氣流吹掃微萃取條件：氮氣流速為2 mL/min,萃取溫度為250 °C,萃取時間為2 min，冷凝溫度為-4 °C。

2.2 揮發(fā)性成分的GC-MS分析

DB-5 MS毛細石英柱(30 m×0.25 mm ×0.25 μm)，載氣He (純度≥99.99%)，進樣口溫度280 °C，進樣量 2 μL，分流比50∶1,載氣流速為0.98 mL/min，升溫程序：45 °C保持1 min,4 °C/min升至250 °C， 6 °C/min升至280 °C，保持5 min。離子源EI,離子源溫度200 °C,電子能量70 eV。

利用島津化學工作站中NIST 10標準質譜圖庫進行檢索，并結合相關文獻圖譜解析對揮發(fā)性成分進行定性分析。同時，應用手動積分方法對信噪比大于10的所有色譜峰進行積分，并按面積歸一化法計算出各化學成分的相對含量，具體見附表1。

表1 尾葉香茶菜不同部位揮發(fā)性成分比較Table 1 Comparative of the volatile components from different parts of Rabdosia excise

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號No.時間Time化合物名稱Compound不同部位含量Content(%)根Root莖Stem葉Leaf189.3382-Oxo-2,5-dihydrofuran(2-[5H]-furanone)1.11.320.42199.433Unknown-40.661.130.59209.5572,5-Dimethylpyrazine0.200.070.07219.671Unknown-50.320.370.28229.911,2-Cyclopentanedione0.713.490.672310.206Unknown-60.050.10-2410.281Unknown-70.070.100.062510.3885-Methyl-2(5H)-Furanone0.110.220.152610.8863-Hydroxy-4,4-dimethyldihydro-2(3H)-furanone0.260.110.12711.0995-Methyl-2-Furanmethanol0.250.180.082811.222,3-Dimethyl-2-cyclopenten-1-one0.110.210.062911.4385-Methyl-2-furaldehyde3.750.600.33011.507Benzaldehyde0.530.420.343111.625Propanoic acid, 1-methylpropyl ester-0.410.113211.742(3E)-3-Methyl-3-hepten-2-one-0.120.113311.852-Methyl-2-butenolide-0.230.123411.8765-Hydroxymethyldihydrofuran-2-one0.16--3512.132Phenol0.311.381.673612.279.alpha.-Methylstyrene0.15--3712.2921-Octen-3-ol-5.753.133812.5662H-Pyran-2,6(5H)-dione0.150.450.173912.6642-n-Pentylfuran0.06--4012.759Acetic acid furfurylester0.060.50-4112.9Unknown-8-0.62-4212.9542,2-Diethyl-3-methyl-1,3-oxazolidine3.79--4313.3982-Formylpyrrole1.10.470.444413.5(E,E)-2,4-Heptadienal-0.170.24513.542Unknown-9-0.07-4613.725Unknown-10-0.160.264713.8293-Methyl-1,2-cyclopentanedione0.241.490.84814.175Unknown-110.20.280.144914.342Benzenemethanol-0.420.545014.7162-Methoxy-5-methylthiophene1.13--5114.75Benzeneacetaldehyde-0.170.245214.975Unknown-12-0.21-5315.05Unknown-13-0.76-5415.094-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)furanone0.44--5515.4292-Acetylpyrrole0.530.350.16

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號No.時間Time化合物名稱Compound不同部位含量Content(%)根Root莖Stem葉Leaf5615.588Hypnone0.560.360.195715.6923-Methyl-2,5-Furandione4.45--5815.7832-(4-Methylcyclohexyl)ethanol-0.170.065915.93-Methylcyclohexanone-0.330.256016.0062,5-Furandicarboxaldehyde0.30--6116.1052-Furyl hydroxymethyl ketone0.370.620.176216.3422-Methoxy-Phenol2.013.250.976316.523-Ethyl-2-hydroxy-2-cyclopenten-1-one0.222.140.896416.7762-Methyl-1,3-cyclohexanedione0.23-0.116516.8333-Ethenyl-3-methylcyclopentanone-2.840.466617.017Linalool-1.190.436717.0512,6-Pyridinediol0.23--6817.202Maltol1.270.730.526917.3334,5-Dimethyl-2-cyclohexen-1-one-0.18-7017.417Benzeneethanol-0.550.917117.779N-methyl-2-formylpyrrole0.13--7217.882Pentanoic acid, pentyl ester--0.327317.892Unknown-14-0.31-7418.196Unknown-150.19--7518.2744-Vinylcyclohexanone-0.340.187618.7671,3-Dimethyltetrahydro-2(1H)-pyrimidinone-0.440.547718.917Unknown-16-0.22-7820.125Unknown-17-0.640.37920.3331,2-Benzenediol0.672.511.38021.35Dihydrobenzofuran-0.521.68121.5745-Hydrxoymethylfurfural1.850.39-8221.705Unknown-180.070.16-8322.534Picolinamide0.11--8422.6662-Hydroxy-4-methylphenol0.121.100.228523.3462,6-Dihydroxyacetophenone0.301.310.478623.8531,7,7-Trimethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl acetate0.27--8724.042Indole--0.488824.6784-Hydroxy-2-methylacetophenone3.523.433.318925.8952,6-Dimethoxy phenol1.135.782.289026.1123-Allyl-2-methoxyphenol0.550.240.639126.242Unknown-19--0.339226.94-Ethyl-1,2-benzenediol-1.241.379327.5124-hydroxy-3-methoxy-Benzaldehyde3.452.410.31

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號No.時間Time化合物名稱Compound不同部位含量Content(%)根Root莖Stem葉Leaf9428.767Unknown-20--0.909529.231cis-Isoeugenol3.741.150.209629.583Unknown-21--0.179729.733Unknown-22--0.199830.1246-Methoxy-3-methylbenzofuran1.01--9930.25(3E)-4-(2,6,6-Trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-3-buten-2-one--0.5710030.2781-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-ethanone0.760.470.1210130.358Unknown-23--0.2910231.2584a-Methyl-4,4a,5,6,7,8-hexahydro-2(3H)-naphthalenone--0.07103Unknown-24--0.110431.565Guaiacylacetone0.651.740.4410531.7584,5,7,7a-Tetrahydro-4,4,7a-trimethyl-2(6H)benzofuranone--0.3910632.6693,5-Dimethoxyacetophenone0.921.660.1410732.925Unknown-25--0.2910833.256Di(sec-butyl) 2-methylsuccinate0.540.430.1410933.3342-Amino-1-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethanone0.660.11-11033.526Diethyl Phthalate0.350.310.3211133.731Unknown-260.290.280.1311233.882Unknown-270.23--11333.9712,6,10,15-Tetramethylheptadecane0.210.260.1311434.5612,4a,5,8a-Tetramethyl-1,2,3,4,4a,7,8,8a-octahydro-1-naphthalenyl acetate3.12-0.2611535.05Unknown-28--0.0911635.377Syringaldehyde1.040.58-11735.558Unknown-29--0.1811835.8Unknown-30--0.2511935.942Unknown-31--0.2212036.308Unknown-32--0.2512136.6482,6-Dimethoxy-4-allylphenol1.681.440.1712237.5333-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-Propenal12.613.340.2512337.6224-((1E)-3-Hydroxy-1-propenyl)-2-methoxy-phenol0.611.11-12437.993Unknown-330.31--12538.339Unknown-340.150.240.0412638.525Unknown-35-0.210.2812740.447(2E)-3,7,11,15-Tetramethyl-2-hexadecen-1-ol2.752.8117.8112840.592Unknown-36-0.340.9312940.982Diisobutyl phthalate0.760.520.4113041.083Unknown-37-0.433.1813141.541Unknown-381.011.006.94

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號No.時間Time化合物名稱Compound不同部位含量Content(%)根Root莖Stem葉Leaf13243.217Unknown-39--0.2613343.361Dibutyl phthalate0.650.480.2113443.6Palmitic acid-0.250.7713543.8243,5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamaldehyde1.681.04-13646.525Nonadecanol--0.9613746.825Methyl linolenate--0.8113847.065Phytol1.161.697.0313947.8Unknown-40--7.3614048.367Unknown-41--0.6814151.067Behenic alcohol--0.3514251.6Unknown-42-0.580.714352.45Unknown-43--0.4114454.533Unknown-44--0.2414555.508Unknown-45-0.49-14657.85Unknown-46-0.41-14758.825Unknown-47--0.3514860.437Spinacene1.110.542.414961.83n-Hexatriacontane0.60.881.58

注：-未檢出。
Note: -not deteated.

2.3 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析采用主成分分析(PCA)方法，利用SPSS Statistics統(tǒng)計軟件完成。

3 結果與討論

3.1 尾葉香茶菜中揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分分析

尾葉香茶菜中共檢測出149個色譜峰，根、莖、葉分別檢測到86、97、106個。與標準譜庫比對，已定性成分各占總成分的93.66%、88.05%、72.62%，尾葉香茶菜中共有102個峰被定性。各部位揮發(fā)性成分的GC-MS分析的總離子流程圖結果見圖1。采用數(shù)據(jù)處理中的手動積分法對每個峰進行積分處理，以峰面積歸一化法測得其中各組分相對百分含量。具體信息見附表1。

圖1 尾葉香茶菜不同部位揮發(fā)性成分總離子流程圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile components in different parts of Rabdosia excise (Maxim.) Hera

文獻報道，尾葉香茶菜揮發(fā)性成分提取方法有CO2超臨界萃取法[6,8]、水蒸氣蒸餾法[7]，兩種方法定性揮發(fā)性成分分別為15和34種，本文采用氣流吹掃微萃取法定性揮發(fā)性成分102種。從樣品消耗量方面考慮以往方法一般需200 g左右[8]，氣流吹掃微萃取法僅需5.0 mg。另外，以往方法至少需要60 min萃取時間[8]，而氣流吹掃微萃取法僅需2 min。綜合上所述，中草藥揮發(fā)性成分定性分析推薦采用氣流吹掃微萃取法。

3.2 不同部位化學組成比較研究

從色譜的總離子流圖可知，尾葉香茶菜的各部分均檢測到多種揮發(fā)性成分，但從總離子流圖中很難直觀區(qū)分三者的差異。另外，即使經檢索、解析和文獻比對，確認每種成分，但仍難以從成分和含量信息中直觀區(qū)分三者。為此，本文分別采用化學和統(tǒng)計學方法進行比較分析。

3.2.1 按不同官能團比較分析

解析已定性成分的結構，發(fā)現(xiàn)所有揮發(fā)性成分都是C4～C36的化合物，涉及化合物類型包含醇類、酮類、醛類、酯類、酚類、酸類等。為此，將所有成分依據(jù)化合物所含官能團共分12類。從圖2可知，根中含量最多的成分是醛類(37.5%)，其次是酮類(12.9%)、其他含N-、O-類(12.4%)及酚類(10.8%)；葉中最多成分為醇類(33.9%)，其次是酮類(10.5%)和酚類(8.81%)；莖中酮類(23.3%)、醇類(19.7%)、酚類(19.2%)三類組分相差不多，其次是醛類(14.9%)。分析結果顯示尾葉香茶菜根、莖、葉中揮發(fā)性物質的組成類型有明顯差異。

圖2 尾葉香茶菜不同部位化學成分官能團分類比較Fig.2 Comparison of functional groups of chemical components in different parts of Rabdosia excise (Maxim.) Hera

3.2.2 主成分(PCA)分析

為了更直觀的辨別尾葉香茶菜不同部位之間是否存在實質性差異，本文采用PCA統(tǒng)計方法進行比較，分別以58個共用成分及全部成分的官能團分類數(shù)據(jù)作為變量，具體結果見圖3和圖4。在圖3中第一個主成分(X-axis：PC1)占57.6%，第二個主成分(Y-axis：PC2)占29.8%。在圖4中第一個主成分(X-axis：PC1)占64.0%，第二個主成分(Y-axis：PC2)占29.6%。在兩種作圖方式中，所選擇的兩個主成分之和占總變量的比例均大于85%。兩種變量的統(tǒng)計分析結果均清晰顯示尾葉香茶菜的三個部位揮發(fā)性成分有明顯差異。通過分析可知每一部位的主要貢獻成分，根中主要貢獻成分是醛類、酮類、其他含N-、O-類及酚類；莖中主要貢獻成分是酮類、醇類和酚類；葉中主要貢獻成分則是醇類、酮類和酚類。該結果顯示，利用統(tǒng)計學方法可以將復雜的藥用植物揮發(fā)性成分數(shù)據(jù)簡單化，可直觀顯示部位之間的異同，這說明統(tǒng)計學方法有望應用于香茶菜屬植物種類之間的鑒別，下一步將開展相關研究，希望能夠為藥用植物間的鑒別提供一種科學、直觀的方法。

圖3 共有成分主成分分析圖Fig.3 PCA diagram of common component

圖4 全部成分的官能團分類主成分分析圖Fig.4 PCA diagram of functional group classification of all components

4 結論

本文研究結果顯示采用氣流吹掃微萃取技術可從尾葉香茶菜中萃取到更多的揮發(fā)性成分，而更多的成分信息可為后續(xù)尾葉香茶菜的深入研究提供基礎。研究結果說明統(tǒng)計方法可應用于植物揮發(fā)性成分的比較中，并將其結果與化學方法相結合，能夠更加直觀準確的說明尾葉香茶菜不同部位中揮發(fā)性成分存在差異及各部位主要貢獻成分。本文對尾葉香茶菜不同部位揮發(fā)性成分的比較研究將為尾葉香茶菜的進一步開發(fā)利用提供基礎數(shù)據(jù)支撐。