慢性胰腺炎動(dòng)物模型研究進(jìn)展

劉日 弓靜

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院影像醫(yī)學(xué)科，上海 200433

【提要】 慢性胰腺炎(CP)的動(dòng)物模型應(yīng)從模擬其發(fā)病機(jī)制、外界刺激、生長環(huán)境、基因缺陷等因素出發(fā)進(jìn)行構(gòu)建。模型的成功構(gòu)建有助于闡明該疾病的病因?qū)W、發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)新的治療措施。本文總結(jié)近年來最常用的CP動(dòng)物模型，概述它們的病理生理學(xué)，并討論它們的優(yōu)點(diǎn)和局限性。

慢性胰腺炎(CP)是一種不可逆的炎癥過程，形態(tài)學(xué)變化主要表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化和腺泡細(xì)胞萎縮。目前CP的早期診斷需要結(jié)合影像學(xué)、胰腺功能測試、臨床表現(xiàn)等進(jìn)行綜合判斷[1-4]。急性胰腺炎(AP)和復(fù)發(fā)性AP可發(fā)展為CP[5]，因此，它們被認(rèn)為是一種連續(xù)性疾病[6]。對胰腺炎發(fā)病機(jī)制的理解主要依賴于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)，CP的動(dòng)物模型應(yīng)從模擬其發(fā)病機(jī)制、外界刺激、生長環(huán)境、基因缺陷等因素出發(fā)進(jìn)行構(gòu)建。本文旨在介紹幾種CP的代表性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

一、藥物注射所致的CP模型

1．雨蛙素注射：重復(fù)注射雨蛙素是CP最常用的造模方法之一。雨蛙素注射的具體操作在不同的研究中有所不同，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[7]小鼠每周兩次雨蛙素腹腔注射(50 μg·kg-1·h-1×6 h)連續(xù)10周可導(dǎo)致急性胰腺損傷，鏡下見腺泡單位周圍和小葉間隙內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)中有前膠原蛋白表達(dá)并隨造模時(shí)間逐步累積。另一項(xiàng)研究[8]采取大鼠水浸應(yīng)激處理5 h，并且每周兩次腹腔注射雨蛙素(20 μg/kg)，16周后鏡下見胰腺萎縮并有明顯的小葉結(jié)構(gòu)破壞、纖維化、脂肪浸潤；同時(shí)出現(xiàn)內(nèi)分泌功能異常。有學(xué)者采取更加密集的注射策略[9-10]，每周3次雨蛙素腹腔注射，6周即可觀察到顯著的腺泡結(jié)構(gòu)改變和更迅速的腺泡周圍纖維化累積。但在刺激停止后，胰腺的纖維化大部分在3～6周內(nèi)逐漸分解，提示胰腺中ECM降解途徑仍有活性[10]。

有研究將雨蛙素聯(lián)合脂多糖(lipopolysaccha ride, LPS)制作CP模型，發(fā)現(xiàn)LPS的聯(lián)合應(yīng)用增加了纖維化的量[11]。Ahmadi等[12]聯(lián)合雨蛙素、乙醇小鼠腹腔注射進(jìn)行CP造模，6周后發(fā)現(xiàn)乙醇聯(lián)合雨蛙素組胰腺的病理變化、TGF-β水平較單用雨蛙素組更顯著，而單純乙醇注射組并未見明顯胰腺病理改變。

2．左旋精氨酸(L-Arg)注射：以500 mg/100 g為初始劑量給大鼠腹腔注射L-Arg，接下來以250 mg/100 g體重的劑量每天注射3次，連續(xù)10 d即可產(chǎn)生CP模型。造模24 h后鏡下胰腺表現(xiàn)為嚴(yán)重的水腫型AP。第5天高達(dá)90%的腺泡破壞并被脂肪組織替代，但導(dǎo)管和胰島細(xì)胞未損。造模成功6個(gè)月后上述病理改變?nèi)源嬖赱13]。Weaver等[14]給大鼠腹腔注射350 mg/100 g L-Arg，每天1次持續(xù)4周，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管周圍、血管、胰腺內(nèi)神經(jīng)和胰島的纖維結(jié)締組織基質(zhì)中僅有少量腺泡細(xì)胞保留。Yamaguchi等[15]發(fā)現(xiàn)，在第一次腹腔注射L-Arg后第54天，85%～90%的腺泡組織被脂肪組織和擴(kuò)張的胰管代替而非纖維化。

3．二丁基二氯化丁基(DBTC)注射：DBTC是一種化學(xué)品，在工業(yè)上用于聚氯乙烯塑料的熱穩(wěn)定。靜脈注射DBTC能誘導(dǎo)慢性胰腺損傷，將DBTC溶于100%乙醇中，與甘油混合后將200 μl體積的DBTC(8 mg/kg體重)尾靜脈注射誘導(dǎo)大鼠CP[16]。DBTC在24 h內(nèi)誘發(fā)急性水腫性胰腺炎，7 d后可觀察到單核細(xì)胞大量浸潤，隨后發(fā)生纖維化，同時(shí)編碼Ⅰ型膠原蛋白的tRNA和TGF-β1表達(dá)上調(diào)，但該造模方式同樣引起嚴(yán)重的肝損害[17]。

Zhang等[18]采取DBTC尾靜脈注射聯(lián)合乙醇喂食進(jìn)行小鼠的CP建模，實(shí)驗(yàn)組小鼠可見急性間質(zhì)性胰腺炎伴胰腺水腫，腺泡細(xì)胞壞死，胰腺持續(xù)炎癥和胰腺永久性纖維化等CP的典型形態(tài)學(xué)改變。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組胰腺基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1) mRNA表達(dá)降低，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1) mRNA表達(dá)升高，削弱了MMP-1降解I型膠原的能力，導(dǎo)致ECM在胰腺中沉積[19]。

二、胰管結(jié)扎所致的CP模型

人類胰腺炎中過氧化物和NO合成酶(NOS)的表達(dá)上調(diào)，胰管結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠胰腺炎模型中腺泡和導(dǎo)管周圍有類似的氧化應(yīng)激和NOS表達(dá)上調(diào)。表明胰管結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠胰腺炎是進(jìn)一步研究人類胰腺炎發(fā)展的適當(dāng)模型[20]。而小鼠和大鼠的完全胰管梗阻主要導(dǎo)致胰腺萎縮，此改變并非CP的特征。胰管結(jié)扎數(shù)月后胰腺的小葉內(nèi)可見脂肪浸潤[21]。因此，單獨(dú)導(dǎo)管結(jié)扎不會導(dǎo)致典型的CP。然而，完全胰管結(jié)扎聯(lián)合雨蛙素給藥在72 h后即可引起大量的間質(zhì)膠原蛋白表達(dá)[22]。

有研究報(bào)道了一種改良的CP模型，具體操作是通過分支導(dǎo)管結(jié)扎結(jié)合雨蛙素給藥實(shí)現(xiàn)建模[23]。在這項(xiàng)研究中，通過結(jié)扎大鼠胃和胰腺十二指腸交界處的胰管來誘導(dǎo)CP，從而避免了膽管及其伴隨動(dòng)脈的損傷。模型鼠在導(dǎo)管結(jié)扎后第2天接受單次雨蛙素給藥(50 μg/ kg)。術(shù)后3 d結(jié)扎的胰腺部分發(fā)生嚴(yán)重的壞死性胰腺炎，模型相關(guān)的死亡率為10%～15%，并始終發(fā)生在注射雨蛙素的48 h內(nèi)，胰腺壞死區(qū)域被纖維化和脂肪組織替代，21 d后檢測到纖維化范圍最大。

三、胰管內(nèi)注射的CP模型

1．牛黃膽酸鈉胰管內(nèi)注射：牛黃膽酸鈉逆行注入大鼠胰管可引起急性出血性胰腺炎，72 h可見明顯的腺泡萎縮和纖維化，然而在單次逆行胰管內(nèi)輸注劑量為40 μl/100 g的3%?；悄懰徕c時(shí)，42 d后胰腺組織學(xué)表型正常，提示該劑量誘導(dǎo)下的胰腺炎是可逆的[24]。另外注射劑量、藥物濃度、注射壓強(qiáng)和持續(xù)時(shí)間可能是這些復(fù)雜表型變化的因素。

2．乙醇膽胰管內(nèi)注射：大鼠胰膽管解剖結(jié)構(gòu)與正常人體存在很大的區(qū)別，其膽總管全長幾乎被胰腺組織包圍，并在其行程中接收若干條胰管匯入，最終開口于十二指腸乳突。Unal等[25]通過剖腹手術(shù)暴露胰腺，使用胰島素注射器將48%乙醇1 ml注入膽管后用1/0絲線縫合膽管，以防止乙醇逆行滲漏。術(shù)后7 d鏡下發(fā)現(xiàn)所有大鼠均發(fā)生CP病理改變，在胰腺組織中見到間質(zhì)纖維化，淋巴管浸潤，導(dǎo)管擴(kuò)張，腺泡細(xì)胞萎縮。

四、改變飲食結(jié)構(gòu)所致的CP模型

1．乙醇相關(guān)性：Maki等[26]在動(dòng)物飲用水中加入濃度為15%的乙醇，2個(gè)月后動(dòng)物血清淀粉酶水平升高，胰腺水腫和腺泡細(xì)胞空泡化，但未見脂肪壞死或胰腺壞死。Ponnappa等[27]給大鼠喂養(yǎng)Lieber-DeCarli飲食9～12個(gè)月，大鼠的胰腺出現(xiàn)雨蛙素誘導(dǎo)產(chǎn)生的CP樣改變。乙醇喂養(yǎng)聯(lián)合雨蛙素注射加劇了胰腺的炎癥反應(yīng)，加劇纖維化程度及腺泡受損萎縮[28-29]。乙醇模型聯(lián)合LPS給藥進(jìn)行CP建模，發(fā)現(xiàn)接受乙醇喂養(yǎng)的大鼠顯示出更嚴(yán)重的腺泡空泡形成，腺泡細(xì)胞壞死，炎癥浸潤和出血，而對照飲食喂養(yǎng)加LPS組中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)胰腺病灶[30]。Gukovsky等[31]報(bào)道了乙醇聯(lián)合環(huán)孢菌素、雨蛙素CP模型，該模型導(dǎo)致胰腺實(shí)質(zhì)減少約86%。

2．慢性高脂飲食：Zhang等[32]采取高脂喂食方案(1%膽固醇，10%動(dòng)物脂肪，0.3% NaTc)飼養(yǎng)10周后發(fā)現(xiàn)胰腺中游離脂肪酸、丙二醛升高，鏡下可見顯著的腺泡細(xì)胞破壞萎縮、脂肪浸潤、間質(zhì)纖維化等典型CP病理表現(xiàn)。乙醇聯(lián)合高蛋白高脂飲食喂養(yǎng)的動(dòng)物模型中可發(fā)現(xiàn)胰酶分泌增加[33]。而低脂飲食、慢性乙醇喂養(yǎng)的大鼠只產(chǎn)生輕度胰腺病理改變，如脂肪變性和間質(zhì)水腫，而乙醇與高脂肪和超高脂飲食可導(dǎo)致腺泡細(xì)胞凋亡增加[34]。

五、遺傳性因素所致的CP模型

絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal-1型(SPINK1)、陽離子胰蛋白酶原基因(PRSS1)、囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)已經(jīng)被證實(shí)與人類CP發(fā)病密切相關(guān)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備這3種顯性遺傳缺陷的小鼠，成為研究人類遺傳性CP很好的實(shí)驗(yàn)對象。

1．CFTR遺傳缺陷型CP模型：囊性纖維化(CF)是一種常見的常染色體隱性遺傳性疾病，一種編碼CFTR氯離子通道的基因被認(rèn)為是CF的致病基因。1992年第一個(gè)CF小鼠模型被建立，此后陸續(xù)開發(fā)出一系列更接近人類的特異性CF模型，這些模型可以出現(xiàn)與人類的CP相似的病理變化[35]。胰腺腺泡細(xì)胞顯著萎縮，小葉間胰腺導(dǎo)管擴(kuò)張并充滿淀粉酶陽性的聚合物，伴有中度的炎性細(xì)胞浸潤。

2．SPINK遺傳缺陷型CP模型：小鼠的SPINK3與人類的SPINK1同源[36]， 兩者編碼產(chǎn)生的胰蛋白酶抑制劑能阻止胰蛋白酶早期在細(xì)胞內(nèi)活化，SPINK3基因敲除的小鼠在胚胎發(fā)育16.5 d后胰腺停止發(fā)育并出現(xiàn)胰腺萎縮，出生后1.5 d胰腺內(nèi)檢測到活化的胰蛋白酶[37]。

3．PRSS1遺傳缺陷型CP模型：人類PRSS1上的精氨酸-組氨酸突變(R122H)導(dǎo)致一種以壞死和慢性炎癥為特征的罕見類型的遺傳性胰腺炎[38]。攜帶胰蛋白酶4的R122H過度表達(dá)的錯(cuò)義突變的轉(zhuǎn)基因小鼠會出現(xiàn)胰腺纖維化[39]，對雨蛙素誘導(dǎo)的AP易感性增加[40]，說明PRSS1突變在胰腺炎發(fā)生過程中起重要作用。

綜上所述，經(jīng)過100多年的努力，科研工作者已經(jīng)開發(fā)出大量的不同類型的CP，為人們研究疾病的病因、發(fā)病機(jī)制及各種治療方法提供了很大的幫助。每個(gè)模型都有自己的優(yōu)點(diǎn)或缺點(diǎn)，研究者應(yīng)根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟⒔Y(jié)合CP模型的特點(diǎn)，來選擇合適的動(dòng)物模型。然而，目前為止還沒有與人類CP發(fā)病完全相同的理想動(dòng)物模型，仍需科研工作者的進(jìn)一步研究。

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