地磷莫斯的免疫抑制效果及機制的研究

王路敏，李艷萍，夏俊杰，葉巖榮*

（1.復旦大學附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院，福建 廈門 361000；

2.莆田醫(yī)學院附屬醫(yī)院，福建 莆田 351100；3.廈門大學醫(yī)學院器官移植研究所，福建 廈門 361102）

在進行同種移植后,移植抗原可刺激受體發(fā)生免疫應答反應,通過細胞免疫和體液免疫的共同作用使移植物受損的情況稱為宿主抗移植物反應[1-2]。同種異體移植的排斥機制：適應性免疫系統(tǒng)識別供體組織上表達的不匹配的HLA等位基因產(chǎn)物[3]，并對排斥作用負責。發(fā)生抗體介導還是T細胞介導（CMI）的排斥,取決于移植組織的來源，如皮膚主要為CMI介導的排斥,而腎臟則為抗體額CMI共同介導。在供體與受體之間HLA不匹配的數(shù)目（移植抗原數(shù)）通常決定排斥作用的強度。

T細胞介導免疫排斥的機制[4]：在同種移植中,Th1細胞主要參與急性排斥反應，Th2細胞的活化可以導致形成移植耐受。Th1細胞分泌IL-2、TNF-β、IFN-γ等,介導細胞免疫應答、器官特異自身免疫性疾病和遲發(fā)型超敏反應，在宿主抗胞內(nèi)病原感染中起重要作用。Th2細胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等細胞因子，介導體液免疫應答、感染性和過敏性疾病[5]。

1 材料與方法

1.1 淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗

刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）是一種很常用的絲裂原，他可以活化T淋巴細胞從而促進T細胞的增殖，Treg（CD4+CD25+）與Teff（CD4+CD25-）的活化都會受到ConA的影響,我們利用刀豆蛋白 A 刺激反應細胞使其進行增殖,在細胞中加梯度濃度的地磷莫斯,檢測細胞增殖程度,判斷其是否被地磷莫斯抑制。

1.2 T細胞克隆無能實驗

反應細胞的提取參照上述淋巴細胞提取過程與T細胞提取過程,刺激劑可以是供體鼠脾臟細胞,也可以是ConA,將刺激劑與反應細胞混合如混合淋巴細胞/淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗，每孔加入100 U/ml IL-2，培養(yǎng)72小時，用Brdu摻入法檢測細胞增殖情況。

1.3 淋巴細胞、T細胞凋亡實驗

1.3.1 細胞提取與處理

淋巴細胞提取如上述方法，將提取好的淋巴細胞1×106加入96孔板內(nèi),并加入梯度濃度的地磷莫斯溶液，培養(yǎng)72小時。

1.3.2 樣品染色

淋巴細胞收集：吸取96孔板內(nèi)的淋巴細胞，置于1.5 mL EP管內(nèi)，加800 uL的PBS清洗。

用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300 g,4℃離心5 min。收集1～5×105 細胞。

加入100μL 1×Binding Buffer重懸細胞。

加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI Staining Solution，輕輕混勻。

避光、室溫反應10 min。

加入400 μL 1×Binding Buffer,混勻，樣品在1小時內(nèi)用流式細胞儀進行檢測。

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 地磷莫斯(deforolimus)對淋巴細胞/T 細胞轉(zhuǎn)化實驗的抑制作用

（1）為了研究地磷莫斯（deforolimus）在體外對淋巴細胞增殖的影響,地磷莫斯是否對淋巴細胞的增殖有抑制作用,其抑制作用是否呈劑量依賴性等,我們提取 B6 小鼠的脾臟細胞,體外用 ConA 刺激增殖,并加入不同濃度的地磷莫斯(地磷莫斯溶解在純酒精里,且濃度為0，0.1，0.5,1，5 μg/mL的儲液,工作濃度為0，1，5，10，50 ng/mL),放入 37℃孵育箱中,培養(yǎng)72小時,使用Brdu摻入法檢測淋巴細胞的增殖情況,結(jié)果：當?shù)亓啄節(jié)舛冗_到1 ng/mL的時候,其抑制率有明顯統(tǒng)計學意義（P＜0.01）,隨著地磷莫斯?jié)舛鹊脑黾樱湟种坡蕸]有顯著性差異。所以，當?shù)亓啄節(jié)舛冗_1 ng/mL時,其抑制率已達到最大。

（2）運用同樣的方法，我們對地磷莫斯抑制T細胞的增殖進行研究,地磷莫斯的加入,明顯抑制了T細胞的增殖,其抑制率大于60%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），隨著藥物濃度的增加，T細胞的抑制率沒有顯著變化，沒有統(tǒng)計學意義。濃度為1 ng/mL的地磷莫斯已對T細胞有顯著的抑制作用。因此，在藥物濃度是1 ng/mL的時候已經(jīng)達到最大抑制率。

2.2 地磷莫斯對淋巴細胞凋亡的影響

在缺血再灌注、組織缺血重構(gòu)、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、腫瘤的發(fā)生等疾病的病理生理機制研究中,關(guān)于凋亡機制的研究具有很大的意義,可以進一步地認識到疾病的本質(zhì),因此可以有針對性地開發(fā)針對凋亡機制的靶向藥物,從而提高療效。

我們研究地磷莫斯是否可以引起淋巴細胞的凋亡，用ConA刺激淋巴細胞培養(yǎng)，不同的孔內(nèi)加入梯度濃度的地磷莫斯（0，1，5，10，50 ng/mL），培養(yǎng)72 h后取出,采用凋亡試劑盒對其進行標記，然后流式上機檢測。地磷莫斯對淋巴細胞凋亡的影響。隨著地磷莫斯?jié)舛鹊脑黾?，淋巴細胞的凋亡比例沒有增加，其變化不具有統(tǒng)計學意義，因此，地磷莫斯不會引起淋巴細胞的凋亡。

2.4 地磷莫斯對T細胞克隆無能的影響

T細胞激活需要兩個信號的刺激：第一信號是形成的pMHC復合物被抗原遞呈細胞（APCs）遞呈給T細胞；第二信號通過T細胞與APCs表面的多對免疫分子結(jié)合，形成共刺激信號。當T細胞缺乏第二信號,其接觸抗原后無反應性,形成了克隆無能狀態(tài)，從而產(chǎn)生特異性T細胞耐受。克隆無能組成外周免疫耐受的主要部分，也是避免自身免疫疾病的重要機制。APCs與共刺激分子的任何一個信號的缺乏都可以誘導T細胞的克隆無能，一些促進T細胞的細胞因子（IL-2）的缺乏也可以誘導T細胞的克隆無能。T細胞被誘導克隆無能后可以通過加入IL-2來恢復其增殖能力，因此，我們可以通過加入IL-2后其增殖能力恢復與否來判斷T細胞是否是被誘導克隆無能而影響其增殖能力。提取脾臟細胞，用尼龍毛過柱，提出T細胞，用ConA刺激T細胞增殖，在不同的孔加入梯度濃度的地磷莫斯（0，0.5，1 ng/mL），濃度為0.5 ng/mL的地磷莫斯沒有對T細胞的增殖沒有起到抑制作用,當?shù)亓啄節(jié)舛冗_1 ng/mL時，T細胞的增殖被抑制，而加入IL-2之后，T細胞的增殖恢復。

由此得知,克隆無能是地磷莫斯對T細胞抑制的作用機制之一。

通過本課題的研究,我們證實地磷莫斯確實有免疫抑制作用，其抑制淋巴細胞的增殖，特別是T細胞的增殖，并且通過誘導克隆無能等方法起到免疫抑制的作用，誘導細胞凋亡不是地磷莫斯起免疫抑制作用的方式。