?花椒提取物對棒頭草的抑制生長和作用機(jī)理研究?

摘 要：采用室內(nèi)生物測定方法，研究了花椒不同溶劑提取物對棒頭草種子萌發(fā)、苗期生長的影響，并測定了乙酸乙酯提取物對幼苗中的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活力、丙二醛（MDA）含量的影響。結(jié)果表明：花椒乙酸乙酯提取物對棒頭草的抑制活力最強(qiáng)，抑制效應(yīng)隨濃度的升高而提高，萌發(fā)抑制率最高可達(dá)到71.86%，有機(jī)溶劑的花椒提取物對棒頭草幼苗的根長、苗高和鮮重均表現(xiàn)為抑制作用，苗高抑制率最高為57.64%。隨著花椒提取物濃度的增加，棒頭草幼苗的POD、SOD活力整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;當(dāng)花椒提取液濃度達(dá)到0.016 g/mL時(shí)，雜草的SOD、POD 活力都急劇下降，此時(shí)雜草體內(nèi)活力氧形成和清除系統(tǒng)之間的平衡被打破，植物自身的抵抗力急劇下降。從而花椒提取液對雜草表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。

關(guān)鍵詞：花椒提取物;棒頭草;種子萌發(fā);生理指標(biāo);抑制效果

中圖分類號：S451 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）10-0077-04

Study on the Inhibition Growth and Effect Mechanism of Zanthoxylum bungeanum

HE Zuo-kuan，WANG Xu，SHI Jun-feng

（Nanya Middle School of Changsha， Changsha 410129， PRC）

Abstract： In this study， Zanthoxylum bungeanum was extracted with different solvent， and then seed germination， seedling growth and SOD， POD activity and MDA content in seedlings of Polypogon fugax were studied in laboratory. The results showed that the ethyl acetate extract has the strongest inhibitory activity on radix paeoniae， and the inhibitory effect increased with the increase of concentration. The germination inhibition rate is up to 71.86%. POD and SOD reflect a regular that the activity is increasing first and then decreasing. The concentration of extract was up to 0.016 g/mL， the SOD and POD activity of the weed decreased dramatically. Then， the balance between the formation of vital oxygen and the clearance system was broken in the weed， and the resistance of the plant declined sharply. Thus， the extract of Zanthoxylum bungeanum showed a strong inhibitory effect on weeds.

Key words： mechanism of Zanthoxylum bungeanum; Polypogon fugax; seed germination; physiological index; inhibition effects

近年來，隨著人們對化學(xué)除草劑危害認(rèn)識的加深，雜草的生物防除方法日益受到關(guān)注。其中，利用植物次生代謝物進(jìn)行雜草防除成為研究熱點(diǎn)[1]。植物次生代謝物是指植物中并非生長發(fā)育所必需的一類小分子有機(jī)化合物，這些物質(zhì)在植物體內(nèi)含量不等，并且有自己獨(dú)特的代謝途徑[2]。研究表明，某些植物次生代謝物是生物毒素的主要來源，可以用于殺蟲、殺菌、除草，而對環(huán)境和人畜無害，為研制環(huán)保型抗蟲害藥劑提供了理想的原料[3-4]。因此，利用植物的次生代謝物控制雜草可以減少化學(xué)除草劑的使用，減輕農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對人工合成除草劑的依賴，緩解農(nóng)業(yè)生產(chǎn)給環(huán)境帶來的負(fù)面影響，維持農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與生態(tài)系統(tǒng)的平衡。

Chiffelle等[5]研究表明加州胡椒樹新老葉乙醇提取物對X. luteola的3齡幼蟲具有良好的防治效果。Duke等[6]從水稻植株中分離出的一種含丙二酸叉結(jié)構(gòu)的化合物，以該化合物為先導(dǎo)物研制出用于防治稻瘟病的殺菌劑稻瘟靈。莫文妍等[7]對桉樹腦的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，合成了一系列衍生物，開發(fā)出環(huán)庚草醚用于防治水稻田稗草等禾本科雜草。Duke等[6]還從紅千層植株中分離出一種具有除草活力的纖精酮，經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后，開發(fā)出磺草酮除草劑，用于防除玉米田多種禾本科雜草和闊葉雜草。此外，酚類、萜烯類、羧酸類、生物堿類等物質(zhì)也具有一定的除草效果[8]，其中部分已經(jīng)被開發(fā)成天然除草劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛的應(yīng)用。

花椒（Zanthoxylum bungeanum）屬蕓香科花椒屬植物，具有良好的醫(yī)療效用，是一種重要的中藥材。揮發(fā)油、酰胺、生物堿、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、黃酮、多酚類物質(zhì)等都是花椒屬植物中最為常見的生物活力成分。胡兆農(nóng)等[9]研究了花椒籽油與氰戊菊酯防治蚜蟲的效果，結(jié)果表明花椒籽油對蚜蟲種群的繁殖有顯著的抑制作用，且對氰戊菊酯有明顯的增效作用。Dube等[10]研究發(fā)現(xiàn)，花椒精油對2種產(chǎn)黃曲霉素的真菌具有明顯的抑菌活力。目前，關(guān)于花椒提取液中是否含有具備除草活力物質(zhì)的報(bào)道較少。因此，試驗(yàn)采用室內(nèi)生物測定方法研究了花椒提取物對棒頭草（Polypogon fugax）種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用，并對其作用機(jī)理進(jìn)行了初步探索，旨在開發(fā)出一種植物源除草劑，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以花椒植株為供體材料、棒頭草的種子為受體植物;材料均于2016年采集自湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院附近。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花椒提取物的制備 將采集的花椒植株陰干，置于50℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，用萬能粉碎機(jī)粉碎，避光保存。稱取適量花椒干粉，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水各1 000 mL反復(fù)浸提3次，每次24 h，抽濾，收集濾液。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀依次在35、46、55、65℃條件下減壓濃縮至膏狀物，分別配制成0.016、0.008、0.004、0.002 g/mL 4個(gè)濃度供生物測定試驗(yàn)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同極性花椒提取物對雜草種子萌發(fā)的影響 采用培養(yǎng)皿濾紙法進(jìn)行種子萌發(fā)測定。選取籽粒飽滿、大小均勻的棒頭草種子，4℃清水浸種24 h打破休眠;用濾紙吸干水分，挑選50粒雜草種子置于鋪有1層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入10 mL不同濃度的花椒提取液，以蒸餾水為對照;所有處理重復(fù)3次，置于（18±1）℃恒溫箱中光照培養(yǎng)，5 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽情況。

1.2.3 不同極性花椒提取物對雜草幼苗的影響 采用盆缽?fù)僚喾y定。在直徑為9 cm的塑料盆缽內(nèi)裝5 cm深的土壤，每盆均勻播種打破休眠的棒頭草種子50粒，均勻覆土，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。雜草長到1.5葉期時(shí)，進(jìn)行間苗，每盆留均勻一致的10株苗;2～3葉期用花椒提取液進(jìn)行莖葉噴霧處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，培養(yǎng)期間按需澆水。

1.2.4 測定指標(biāo)及方法 于處理5 d后測定植株的生長指標(biāo)（包括苗高、根長及整株鮮重）。以乙酸乙酯的花椒提取液噴霧處理5 d后的幼苗為樣本，測定指標(biāo)包括超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）的活力以及丙二醛（MDA）的含量。采用氮藍(lán)四唑還原法測定植株中SOD的活力[11]，采用愈創(chuàng)木酚法測定植株中POD的活力[12-13]，采用硫代巴比妥酸法測定MDA的含量[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS、DPS軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Excel 2016軟件作圖，供試雜草幼苗各項(xiàng)生長生理指標(biāo)數(shù)值均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。各指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

萌發(fā)抑制率（%）=（對照組種子發(fā)芽數(shù)-處理組種子發(fā)芽數(shù)）/對照組種子發(fā)芽數(shù)×100

株高（根長、鮮重）抑制率（%） =[對照株高（根長、鮮重）-處理株高（根長、鮮重）]/對照株高（根長、鮮重）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同極性花椒提取液對棒頭草種子萌發(fā)的影響

不同極性的花椒提取物對棒頭草的作用強(qiáng)弱不同。如圖1所示，隨著提取液濃度的增大，棒頭草種子萌發(fā)抑制效果隨之增強(qiáng)。其中，棒頭草種子在0.002 g/mL水提取液中，萌發(fā)抑制率僅為2.71%，無明顯抑制效果。相比較而言，乙酸乙酯花椒提取物的抑草活力最強(qiáng)，抑制效果最高可達(dá)70%以上。綜合分析，不同極性花椒提取液對棒頭草種子萌發(fā)的抑制強(qiáng)度從大到小排列依次為乙酸乙酯>正丁醇>石油醚>水。

2.2 不同極性花椒提取液對供棒頭草幼苗生長的影響

如表1所示，4種不同極性的花椒提取物對棒頭草的作用效果存在一定的差異，除水提取液表現(xiàn)出“低促高抑”的特點(diǎn)外，其余生長抑制率多數(shù)與濃度呈正相關(guān)關(guān)系，表現(xiàn)出一定的抑制作用。在0.016 g/mL濃度下，對棒頭草苗高的抑制作用由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯>正丁醇>石油醚>水，苗高抑制率分別57.64%、53.56%、37.81%、13.82%。同時(shí)，棒頭草在不同濃度提取液的處理下，苗高、根長、鮮重各項(xiàng)指標(biāo)的響應(yīng)趨勢大致相同，均隨濃度的增大抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，鮮重抑制率最高為64.07%，敏感程度表現(xiàn)為苗高>鮮重>根長。

2.3 花椒提取液對棒頭草超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響

SOD作為生物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，是生物體內(nèi)專一清除O2·-的酶類，它在活力氧清除系統(tǒng)中占有十分重要的位置。由圖2可知，隨著花椒提取液濃度的不斷增大，雜草幼苗體內(nèi)SOD活力呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢;在0.004 g/mL濃度時(shí)，活力值最高，相比對照增加154.64%;當(dāng)濃度達(dá)到0.016"g/mL時(shí)，酶活力值為249.65 U/mg，顯著低于對照。這說明高濃度的花椒提取液對受體雜草體內(nèi)的SOD活力抑制明顯，使雜草體內(nèi)的自由基產(chǎn)生和清除平衡被打破，從而對細(xì)胞產(chǎn)生傷害作用。

2.4 花椒提取液對棒頭草過氧化物酶（POD）活力的影響

過氧化物酶（POD）在活力氧代謝過程中發(fā)揮著重要的作用，POD是通過催化過氧化氫與其他底物反應(yīng)來消耗過氧化氫，以抵御植物在逆境脅迫下產(chǎn)生的有害物質(zhì)對細(xì)胞的傷害，從而表現(xiàn)出一定的抗逆性。如圖3所示，棒頭草體內(nèi)POD的酶活力隨提取液濃度的增加呈現(xiàn)“低—高—低”的變化特點(diǎn);低濃度處理下，POD活力有明顯的升高趨勢，當(dāng)濃度為0.004 g/mL時(shí)，POD活力升高到最大值，相比對照增加了1.18倍;當(dāng)濃度達(dá)到0.016 g/mL時(shí)，酶活力值為159.81 U/mg，比對照低9.86%，無顯著差異。這說明在高濃度花椒提取液處理下，棒頭草的POD活力迅速下降，開始失去了對細(xì)胞的保護(hù)作用。

2.5 花椒提取液對棒頭草丙二醛（MDA）含量的影響

當(dāng)植物受逆境脅迫或衰老時(shí)，體內(nèi)活力氧代謝失衡，會(huì)引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量可以用于考察細(xì)胞所受脅迫的嚴(yán)重程度以及膜系統(tǒng)受損傷程度和植物的抗逆性。如圖4所示，棒頭草幼苗MDA含量隨花椒提取液濃度的增大而逐漸升高，提取液濃度在0～0.002 g/mL范圍內(nèi)，MDA的含量沒有明顯變化;此后，隨著濃度的增加，MDA積累量明顯增加，當(dāng)提取液濃度為0.008 g/mL和0.016g/mL時(shí)，MDA的含量分別為對照的2.18和3.40倍。這說明花椒提取液能使棒頭草的膜系統(tǒng)發(fā)生過氧化，并且膜系統(tǒng)受損程度與花椒提取液濃度呈正相關(guān)性。

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)對植物的更新起著關(guān)鍵作用，發(fā)芽率低則植物幼苗少，從而影響著該植物在群落中的優(yōu)勢度。棒頭草萌發(fā)抑制率與花椒提取液濃度呈正相關(guān)，抑制效果最高可達(dá)70%以上，表明花椒提取液具有防除棒頭草的潛力。此外，花椒提取液對受體雜草幼苗的生長主要表現(xiàn)為抑制作用，濃度越高，抑制效果越強(qiáng)，其中乙酸乙酯提取的效果最好。因此，通過對花椒化感作用的研究，可以為新型除草劑的開發(fā)提供參考。

當(dāng)植物受逆境脅迫時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞，致使一些活力氧積累，影響生物膜的功能，對植物造成傷害。而SOD可以催化氧自由基的歧化反應(yīng)，生成過氧化氫，POD協(xié)助其轉(zhuǎn)化成無害的水和分子氧，才能維持活力氧的代謝平衡，保證植物的正常生長。MDA是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量可反映膜脂過氧化的程度。因此，測量這些生理指標(biāo)，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化，已被廣泛用于植物的抗性和化感效應(yīng)研究。該試驗(yàn)中，MDA含量與花椒提取液濃度呈正相關(guān)關(guān)系，表明隨著花椒提取液濃度的增加，棒頭草過氧化作用越來越明顯。此外，SOD、POD的酶活力整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。低濃度處理下，為防止活力氧積累造成的毒害，棒頭草體內(nèi)SOD、POD活力開始升高，體現(xiàn)出棒頭草自身的抗性。但這種能力是有限的，當(dāng)花椒提取液濃度達(dá)到0.016 g/mL時(shí)，雜草的SOD、POD 活力都急劇下降，此時(shí)雜草體內(nèi)活力氧形成和清除系統(tǒng)之間的平衡被打破，植物自身的抵抗力急劇下降。從而花椒提取液對雜草表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。

研究初步明確了花椒提取液對棒頭草的抑制作用，但想要進(jìn)一步開發(fā)花椒的除草活性，還需深入研究其活性成分，并開展田間藥效試驗(yàn)，才能確定其活性物質(zhì)是否能開發(fā)成新型除草劑。

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