棕櫚酸通過上調(diào)受體Frizzled-2及Ror-2表達抑制胰島β細胞系INS-1增殖*

吳杏兒， 鄭 磊， 孫世珺

(1中山市人民醫(yī)院分子診斷中心， 廣東 中山 528403； 2南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院檢驗科， 廣東 廣州 510515)

脂代謝異常與2型糖尿病密切相關(guān)，血脂異?？沙霈F(xiàn)于糖尿病前期，成為促進2型糖尿病發(fā)病的因素之一[1]。血循環(huán)中游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs)升高對胰島β細胞的損害，一方面表現(xiàn)為長期脂毒性導致胰島素分泌功能減退[2]，另一方面則表現(xiàn)為引起胰島β細胞數(shù)量明顯減少。動物及人類成體胰島β細胞數(shù)量的維持依賴于細胞增殖及凋亡平衡[3]。體外實驗發(fā)現(xiàn)， FFAs對嚙齒類動物及人的胰島β細胞同時產(chǎn)生誘導凋亡及抑制增殖的效應[4-5]。迄今已有大量研究闡釋FFAs如何誘導β細胞凋亡，例如在多種不同來源的胰島β細胞中神經(jīng)酰胺通路已被證實與β細胞凋亡關(guān)系緊密[4]; FFAs介導線粒體膜損傷導致一系列細胞因子(如細胞色素C)釋放，可誘導β細胞凋亡[6]。然而，F(xiàn)FAs抑制胰島β細胞增殖的機制尚不清楚。進一步研究FFA抑制胰島β細胞增殖的可能機制，不僅對了解脂毒性參與糖尿病發(fā)病和發(fā)展有所幫助，更有助于未來可能的藥物開發(fā)甚至治療策略的改進。

Wnt信號通路是一類參與調(diào)節(jié)器官發(fā)育和細胞有絲分裂等多方面的重要信號通路，該通路不同層面的信號分子，包括Wnt配體及其受體，如卷曲蛋白受體(Frizzled receptors)和受體酪氨酸激酶樣孤兒受體(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor，Ror)等在胰腺組織中均有不同程度的表達[7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Wnt配體家族成員之一Wnt5a在β細胞系及小鼠胰島中基礎(chǔ)表達豐度高，并可顯著抑制β細胞增殖[8]。然而，在不同類型的組織細胞中Wnt5a對細胞增殖的影響截然不同，這種現(xiàn)象可能是因為Wnt5a與不同受體結(jié)合將激活不同的信號通路[9]，因此明確β細胞中介導Wnt5a調(diào)控細胞增殖的受體類型具有重要意義。體外實驗中，我們發(fā)現(xiàn)受體Frizzled-2(Fzd-2)及Ror-2可介導Wnt5a激活鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)通路，從而下調(diào)細胞周期因子cyclin D1表達，最終抑制β細胞增殖。近來研究發(fā)現(xiàn)Fzd-2與脂代謝異常密切相關(guān)，F(xiàn)zd-2介導Wnt5a參與調(diào)控脂肪性肝硬化發(fā)展過程[10]。但受體Fzd-2及Ror-2是否參與介導脂毒性抑制胰島β細胞增殖，目前尚無相關(guān)報道。因此本實驗采用飽和脂肪酸棕櫚酸(palmitic acid, PA)刺激大鼠胰島β細胞系INS-1，采用RT-qPCR、Western blot及免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)技術(shù)，檢測棕櫚酸對INS-1細胞Fzd-2和Ror-2表達的調(diào)控作用，并運用siRNA干擾受體Fzd-2及Ror-2表達，再予棕櫚酸刺激，采用EdU標記法明確受體Fzd-2及Ror-2在棕櫚酸抑制INS-1細胞增殖中的作用，為探索脂毒性抑制β細胞增殖機制提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要材料

大鼠胰島β細胞系INS-1購自ATCC。小牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；棕櫚酸、BSA、2-巰基乙醇、HEPES和二甲基亞砜購自Sigma；siRNA由廣州吉捷生物科技有限公司合成提供；EdU試劑盒購自廣州市銳博生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen；羊抗人Fzd-2抗體(交叉抗大鼠)購自Abcam；兔抗人/鼠Ror-2抗體、兔抗鼠Wnt5a抗體和兔抗鼠GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology；抗Wnt5a單克隆抗體購自Santa Cruz；辣根過氧化酶標記IgG購自弗德生物技術(shù)有限公司；Pierce Direct IP Kit試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；EastepTM通用型總RNA提取試劑盒、GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒和GoTaq?qPCR Master Mix購自Promaga。熒光定量PCR儀7500購自ABI；倒置熒光顯微鏡購自O(shè)lympus。所有引物均由Invitrogen合成。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 將INS-1細胞培養(yǎng)在37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中，每100 mL細胞培養(yǎng)液含有10%小牛血清、1%青/鏈霉素、2-巰基乙醇貯存液35 μL、碳酸氫鈉0.2 g和10 μmol/L HEPES 0.1 mL。以含0.25%胰酶消化細胞傳代，每隔24 h更換1次培養(yǎng)液。

2.2EdU標記染色法檢測細胞增殖率 細胞分為無意義siRNA轉(zhuǎn)染+溶劑BSA(陰性對照，negative control， NC)組、無意義siRNA轉(zhuǎn)染+棕櫚酸(NC+PA)組和siRNA-Fzd-2/Ror-2轉(zhuǎn)染+棕櫚酸組(針對Fzd-2和Ror-2各設(shè)置2組不同有效序列siRNA轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染36 h后予500 μmol/L棕櫚酸繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

各組細胞以每孔4×104的密度種植至鋪有蓋玻片的24孔板，細胞貼壁后更換培養(yǎng)基，進行轉(zhuǎn)染或共培養(yǎng)，離觀察終點2 h前往培養(yǎng)基中加入EdU溶液(終濃度為50 μmol/L)，按試劑盒說明固定細胞、染色及鋪片。使用倒置熒光顯微鏡，觀察Appolo 567染色使用550 nm激發(fā)光，觀察Hoechst 33342染色使用350 nm激發(fā)光，放大倍數(shù)為400。每復孔等分4象限，每象限隨機拍攝3張不同視野照片均計數(shù)，分別計算Hoechst(細胞核)及Appolo(增殖細胞)染色細胞數(shù)，Appolo/Hoechst比值為細胞增殖率，每復孔Hoechst染色陽性細胞計數(shù)>1 000個。同組設(shè)3個復孔，取增殖率平均數(shù)及標準差。

2.3細胞轉(zhuǎn)染 除按照EdU標記實驗的分組外，另設(shè)無意義siRNA轉(zhuǎn)染組、siRNA-Fzd-2-1轉(zhuǎn)染組、siRNA-Fzd-2-2轉(zhuǎn)染組、siRNA-Ror-2-1轉(zhuǎn)染組和siRNA-Ror-2-2轉(zhuǎn)染組。按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明，分別將含有1 μg無意義siRNA、siRNA-Fzd-2-1(5’-UGCAUCAAUUCUACCCGCUGGUGAAd-Td-3’，5’-UUCACCAGCGGGUAGAAUUGAUGCAdTd-3’)、siRNA-Fzd-2-2(5’-CGUCCUAUCUCAGCUAU-AAGUUUCUdTd-3’， 5’-AGAAACUUAUAGCUGAGA-UAGGACGdTd-3’)、siRNA-Ror-2-1(5’-CCAUUGACACCUUGGGACAACUUGAdTd-3’，5’-UCAAGUUGU-CCCAAGGUGUCAAUGGdTd-3’)及siRNA-Ror-2-2(5’-CCAUUACCGCCACUGGUGUUCUGUAdTd-3’，5’-UA-CAGAACACCAGUGGCGGUAAUGGdTd-3’)的稀釋液加入含無血清培養(yǎng)基的EP管中混勻，緩慢加入含1 μL LipofectamineTM2000的50 μL無血清培養(yǎng)基中，混勻后室溫靜置20 min形成轉(zhuǎn)染復合物。使用轉(zhuǎn)染復合物培養(yǎng)細胞6～8 h后吸出轉(zhuǎn)染復合物，換含有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收集細胞用于Western blot檢測或EdU標記染色進行細胞增殖率計數(shù)。

2.4免疫共沉淀 按Pierce Direct IP Kit試劑盒說明將抗Wnt5a單克隆抗體通過共價偶聯(lián)結(jié)合到瓊脂糖樹脂。細胞經(jīng)BSA或200 μmol/L棕櫚酸刺激6 h后棄培養(yǎng)液，用試劑盒中1×Coupling Buffer洗滌細胞1次，冰上操作加入IP裂解液裂解5 min，裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中13 000×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至離心管中，留取部分進行蛋白定量及Western blot分析，其余按試劑盒說明進行免疫共沉淀。免疫沉淀反應后，按試劑盒說明用洗脫緩沖液洗脫蛋白，室溫孵育10 min后離心收集洗脫液，用于后續(xù)Western blot分析。

2.5RT-qPCR實驗 細胞共分5組：BSA溶劑對照組及200 μmol/L棕櫚酸刺激3 h、6 h、12 h和24 h組。按試劑盒說明于冰面操作提取對數(shù)生長期細胞總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄，反應條件：25 ℃退火5 min，延伸1 h，70 ℃滅活15 min。cDNA樣本-20 ℃保存?zhèn)溆?。RT-qPCR反應總體系為20 μL，包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物樣本5 μL、無酶核酸水4 μL、引物0.8 μL、Master Mix (2×)10 μL和CXR(100×)0.2 μL。反應條件： 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s、 60 ℃ 1 min(40個循環(huán))。Fzd-2及Ror-2相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算，內(nèi)參照為β-actin。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.6Western blot實驗 時間梯度實驗分6組：BSA溶劑對照組及200 μmol/L棕櫚酸刺激1 h、3 h、6 h、12 h和24 h組；濃度梯度實驗分4組：BSA溶劑對照組及200、500和1 000 μmol/L棕櫚酸刺激6 h組。至觀察終點棄去培養(yǎng)基加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白。12% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，4% BSA封閉2 h，PBS洗膜3次后加 I 抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜3次加 II 抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜后再在暗室中加入發(fā)光劑，顯影后定影。以GAPDH為內(nèi)參照，ImageJ軟件灰度掃描圖像檢測Fzd-2及Ror-2蛋白表達的差異。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。每組設(shè)置3次重復獨立實驗，結(jié)果均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間差異比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 棕櫚酸誘導INS-1細胞受體Fzd-2和Ror-2的mRNA表達

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，經(jīng)棕櫚酸刺激后INS-1細胞受體Fzd-2及Ror-2 mRNA水平升高。與溶劑對照組相比，細胞自棕櫚酸刺激6 h后Fzd-2的mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，且隨刺激時間延長逐漸增加；經(jīng)棕櫚酸處理3 h后， Ror-2的mRNA表達水平升高，刺激12 h后達峰值(P<0.05)，見圖1。

2 棕櫚酸促進INS-1細胞受體Fzd-2和Ror-2的蛋白表達

Western blot檢測200 μmol/L棕櫚酸處理細胞后Fzd-2及Ror-2蛋白隨時間表達變化，結(jié)果顯示INS-1細胞中的Fzd-2及Ror-2蛋白表達水平逐漸增加(P<0.05)，見圖2A；使用不同濃度棕櫚酸刺激細胞6 h，結(jié)果顯示細胞Fzd-2及Ror-2的蛋白表達水平隨棕櫚酸刺激濃度升高而增加(P<0.05)，見圖2B。

3 棕櫚酸促進INS-1細胞中Wnt5a與受體Fzd-2、Ror-2結(jié)合

Co-IP檢測棕櫚酸刺激下細胞中Wnt5a與受體Fzd-2和Ror-2結(jié)合的變化，結(jié)果顯示，與BSA溶劑對照組相比，200 μmol/L棕櫚酸刺激6 h可顯著促進Wnt5a募集Fzd-2和Ror-2(P<0.05)，見圖3。

4 沉默F(xiàn)zd-2和Ror-2表達對棕櫚酸抑制INS-1細胞增殖的影響

siRNA瞬時轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)zd-2及Ror-2，轉(zhuǎn)染36 h后Western blot 檢測結(jié)果顯示siRNA序列有效降低Fzd-2和Ror-2表達，見圖4A、B。分別使用siRNA-Fzd-2和siRNA-Ror-2轉(zhuǎn)染細胞36 h后予500 μmol/L棕櫚酸繼續(xù)刺激細胞24 h，EdU標記法檢測細胞增殖率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染無意義siRNA的情況下，棕櫚酸顯著降低細胞增殖率(P<0.05)，沉默F(xiàn)zd-2及Ror-2均能減弱棕櫚酸抑制細胞增殖的效應(P<0.05)，見圖4C、D。

Figure 1.Palmitic acid (PA) activated the mRNA expression of Fzd-2 and Ror-2 in INS-1 cells. INS-1 cells were exposed to 200 μmol/L PA for 3 h, 6 h, 12 h and 24 h, and the mRNA levels of Fzd-2 and Ror-2 were detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

Figure 2.Palmitic acid (PA) up-regulated the protein expression of Fzd-2 and Ror-2 in the INS-1 cells. INS-1 cells were exposed to 200 μmol/L PA for the indicated time points (A) or to various concentrations of PA for 6 h (B). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

Figure 3.Palmitic acid (PA) promoted the interaction between Wnt5a and Fzd-2/Ror-2 in INS-1 cells. The cells were treated with BSA or PA (200 μmol/L) for 6 h. The results of co-immunoprecipitation demonstrating the interaction between Wnt5a and Fzd-2/Ror-2. The cell lysates were first immunopurified using monoclonal anti-Wnt5a antibody. Wnt5a and co-immunoprecipitated Fzd-2/Ror-2 were determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

討 論

Wnt信號通路在細胞繁殖和生物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。Wnt基因編碼一類分泌型糖蛋白，既可與自身細胞膜受體結(jié)合，也可與鄰近細胞的膜受體結(jié)合。不同的Wnt蛋白既可起相同作用，也可產(chǎn)生不同的效應[11]。本課題組前期研究通過體內(nèi)外實驗，發(fā)現(xiàn)GLP-1受體長效激動劑exendin-4促進INS-1細胞及小鼠胰島β細胞增殖過程中，Wnt5a是所有19個Wnt配體中唯一一個基礎(chǔ)表達豐度高但其表達卻隨細胞增殖率升高顯著下調(diào)的亞型。我們發(fā)現(xiàn)在INS-1細胞中Wnt5a通過激活非經(jīng)典Wnt/CaMKⅡ通路抑制β-catenin轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)cyclin D1表達，這揭示了Wnt5a可能是抑制胰島β細胞增殖的重要調(diào)控因子。有趣的是，既往文獻報道Wnt5a對不同組織來源細胞增殖活性作用不一。在乳腺上皮細胞和非小細胞肺癌中Wnt5a表現(xiàn)促細胞增殖效應[12-13]；然而在B淋巴細胞瘤和結(jié)直腸癌等組織細胞中Wnt5a卻表現(xiàn)為抑制細胞增殖[14-15]。這種復雜作用可能是由于Wnt5a通過結(jié)合不同的特異性受體發(fā)揮活性作用引起的[16]。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)了受體Fzd-2及Ror-2均參與介導Wnt5a調(diào)控INS-1細胞增殖，并且發(fā)現(xiàn)棕櫚酸可通過調(diào)控Wnt5a信號通路抑制β細胞增殖。因此，本實驗中著重關(guān)注了Wnt5a受體Fzd-2及Ror-2在棕櫚酸抑制β細胞增殖過程中的作用。

Wnt蛋白的受體Fzd蛋白是一組7次跨膜蛋白，具有與G蛋白偶聯(lián)受體相似的結(jié)構(gòu)，廣泛表達于多種器官組織。Fzd蛋白高度保守的富含半胱氨酸配體結(jié)合區(qū)是Fzd與Wnt相結(jié)合的部位，不同F(xiàn)zd受體傾向于不同的信號通路。Slusarski等[17]于斑馬魚胚胎異位表達Fzd-2受體及Wnt5a，發(fā)現(xiàn)Wnt5a可通過Fzd-2受體促進胞內(nèi)鈣釋放。胞內(nèi)鈣濃度升高激活CaMKⅡ， 有研究者通過體內(nèi)外實驗證實Wnt5a激活小鼠B淋巴細胞的CaMKⅡ通路下調(diào)cylcin D1表達而抑制細胞增殖。然而異位表達大鼠Fzd-1不能增加胞內(nèi)鈣離子濃度，也無法激活CaMKⅡ。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)狀態(tài)下Wnt5a經(jīng)受體Fzd-2介導可激活CaMKⅡ通路抑制INS-1細胞增殖，并發(fā)現(xiàn)Wnt5a參與介導棕櫚酸抑制INS-1細胞增殖。因此本研究使用棕櫚酸刺激INS-1細胞，并檢測細胞Fzd-2 mRNA及蛋白水平的表達變化。鑒于棕櫚酸具有較強的細胞毒性，為避免損失過多細胞以提取足量RNA及蛋白，時間梯度實驗中采用較低濃度(200 μmol/L)棕櫚酸處理細胞；此外前期實驗發(fā)現(xiàn)500 μmol/L棕櫚酸抑制INS-1增殖更為顯著，故siRNA轉(zhuǎn)染實驗中采用該濃度棕櫚酸刺激細胞。本實驗發(fā)現(xiàn)棕櫚酸在抑制細胞增殖的同時可顯著上調(diào)受體Fzd-2的表達，并促進配體Wnt5a募集該受體，提示我們受體Fzd-2作為Wnt5a信號通路的一環(huán)，是介導脂毒性抑制β細胞增殖的重要調(diào)控因子。至于Fzd-2是否仍通過介導Wnt5a/CaMKⅡ信號通路參與棕櫚酸抑制β細胞增殖，尚待我們進一步的實驗探索。

Figure 4.The effects of Fzd-2 and Ror-2 silencing on palmitic acid (PA)-induced inhibition of INS-1 cell proliferation. A and B: the protein expression of Fzd-2 and Ror-2 was determined by Western blot analysis; C and D: quantification of EdU incorporation assay and representative images were showed (×400). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs NC+PA group.

本研究首次發(fā)現(xiàn)棕櫚酸可通過調(diào)控受體Fzd-2表達抑制INS-1細胞增殖，然而目前尚無相關(guān)報道揭示棕櫚酸調(diào)控Fzd-2表達的具體分子機制。我們對大鼠Fzd-2基因序列進行啟動子元件分析，發(fā)現(xiàn)在Fzd-2啟動子區(qū)域可能存在與轉(zhuǎn)錄因子c-Fos結(jié)合的序列。Roche等[18]發(fā)現(xiàn)棕櫚酸刺激INS-1細胞可顯著上調(diào)c-Fos蛋白表達，這提示棕櫚酸可能通過上調(diào)c-Fos轉(zhuǎn)錄因子的表達促進Fzd-2基因表達。前期實驗中我們發(fā)現(xiàn)棕櫚酸上調(diào)INS-1細胞的Wnt5a表達，而前人研究表明Wnt5a可引起胞內(nèi)鈣釋放，棕櫚酸募集c-Fos又需要胞內(nèi)鈣濃度升高[18]。這提示我們Wnt5a既是受體Fzd-2的配體，也可能參與介導棕櫚酸調(diào)控Fzd-2表達，形成了一個調(diào)控網(wǎng)絡。

Ror受體家族是一類Ⅰ型跨膜蛋白酪氨酸激酶，在無脊椎及脊椎動物中基因序列高度保守，其胞外結(jié)構(gòu)具有與Fzd蛋白相似的CRD，也是Ror受體與Wnt蛋白結(jié)合的重要區(qū)域。在哺乳類動物中Ror-2受體可與Wnt5a結(jié)合，直接抑制依賴β-catenin的經(jīng)典Wnt信號通路[19]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Ror-2參與介導Wnt5a抑制INS-1細胞增殖，Wnt5a信號通路的激活不僅降低全細胞β-catenin濃度，同時也抑制β-catenin與TCF/LEF結(jié)合成有效的轉(zhuǎn)錄復合物，最終下調(diào)下游cyclin D1表達。本研究首次報道受體Ror-2參與介導棕櫚酸調(diào)控INS-1細胞增殖，棕櫚酸刺激細胞后顯著上調(diào)Ror-2 mRNA及蛋白水平的表達，并促進Wnt5a募集 Ror-2，從而抑制細胞增殖。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)在介導Wnt5a抑制INS-1增殖的過程中，受體Fzd-2可能比Ror-2占更重要的地位。而本研究中使用siRNA沉默F(xiàn)zd-2比沉默Ror-2更能顯著地減弱棕櫚酸對細胞增殖的抑制作用。這一現(xiàn)象與我們的前期研究結(jié)果相符，并提示在介導棕櫚酸抑制β細胞增殖中Fzd-2受體可能更重要。

綜上所述，本研究首次明確了棕櫚酸通過上調(diào)受體Fzd-2及Ror-2表達，并促進其與調(diào)控β細胞增殖的重要因子Wnt5a結(jié)合，從而抑制INS-1細胞增殖。