微小RNA-497抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞活力、侵襲和遷移*

張莉君， 葉 穎， 張遂亮， 莊菊花， 夏 偉

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院， 上海 200137)

甲狀腺乳頭狀癌 (papillary thyroid cancer，PTC)由濾泡或?yàn)V泡旁甲狀腺細(xì)胞形成，是甲狀腺最常見的腫瘤類型，占甲狀腺惡性腫瘤的80%左右[1]。目前，隨著標(biāo)準(zhǔn)治療的發(fā)展，絕大多數(shù)PTC患者預(yù)后良好，然而約10%～15%的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的情況[2]。此外，晚期PTC患者經(jīng)常出現(xiàn)周圍結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移，例如喉嚨、氣管、會(huì)厭、食管和宮頸血管等[3]。有鑒于此，必須了解PTC進(jìn)展的機(jī)制，為該疾病患者研究制定新的治療方法。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一系列小型內(nèi)源性非編碼高度保守的RNA分子，主要以堿基配對(duì)的方式直接結(jié)合其在3’非翻譯區(qū)(3’-untranslation region，3’UTR)的靶基因，起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子的作用，從而導(dǎo)致mRNA斷裂或翻譯抑制[4]。眾所周知，單個(gè)miRNA可以通過靶向特異性的豐度和發(fā)散度對(duì)大量的靶基因進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)[5]。幾十年來，miRNA已被證實(shí)在多種細(xì)胞生物過程中發(fā)揮著重要作用，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、發(fā)育、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤生成[6]。最近，miRNA被發(fā)現(xiàn)在多種人類腫瘤中表達(dá)異常，如PTC、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌和結(jié)直腸癌等[7-11]。此外，新近研究表明miRNAs具有腫瘤抑制因子或癌基因功能，在PTC形成和進(jìn)展過程中起著關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)表明miRNA可作為PTC治療的潛在治療靶點(diǎn)。

在此，我們對(duì)miR-497的直接靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)和驗(yàn)證，并對(duì)基于靶基因miR-479抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

材 料 和 方 法

1 材料

胎牛血清、青霉素、鏈霉素和DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco；TRIzol試劑、PrimeScript RT試劑盒、Lipofectamine 2000、pGL3-AKT3-3’UTR Wt、pGL3-AKT3-3’UTR Mut、miR-497模擬物(miR-497 mimics)和陰性對(duì)照miRNA模擬物(negative control miRNA, miR-NC)均購自上海吉瑪基因；抗體購自Santa Cruz；AKT3 siRNA和NC siRNA購自廣州銳博生物科技有限公司；MTT試劑購自Sigma；Transwell小室購自Corning。

2 組織標(biāo)本和細(xì)胞系

43例PTC患者手術(shù)切除的原發(fā)性PTC組織及相鄰的甲狀腺組織取自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院,所有患者均未接受新的輔助治療。所有組織在手術(shù)后立即快速冷凍并儲(chǔ)存在-80 ℃的環(huán)境中。本研究由上海中醫(yī)藥大學(xué)第七人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均上交了書面知情同意書。

2種人體PTC細(xì)胞系(TPC-1和HTH83)均購自美國(guó)菌種保藏中心,均由含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

3 主要方法

3.1RT-qPCR反應(yīng) 在液氮冷凍條件下，將標(biāo)本組織研磨成粉末，每100 mg組織加入1.0 mL TRIzol裂解液，充分裂解后，4 ℃、 10 000 r/min離心3 min，取上清。向上清中加入200 μL氯仿，劇烈振蕩30秒，室溫放置3 min，4 ℃、 11 000 r/min離心15 min，小心吸取上層水溶液，加入等體積的異丙醇沉淀RNA，最后用DEPC水溶解沉淀，得到RNA溶液。使用NanoDrop 1000分光光度計(jì)評(píng)估總RNA的純度和濃度，-80 ℃保存。使用PrimeScript RT試劑盒合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq在Applied Biosystems 7900HT實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中進(jìn)行qPCR。設(shè)置GAPDH為內(nèi)參照。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR所用引物序列

3.2基因轉(zhuǎn)染 用6孔板將細(xì)胞以60%～70%的密度接種到不含胎牛血清的DMEM中。黏附后，使用Lipofectamine 2000試劑分別將miR-497 mimics、 miR-NC、AKT3 siRNA和NC siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。培養(yǎng)6 h后，用含有10%胎牛血清的DMEM置換培養(yǎng)基。

3.3MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并將其接種到96孔板中，密度為每孔4 000個(gè)。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、2、3和4 d之后，分別進(jìn)行MTT測(cè)定。將10 μL MTT溶液(5 g/L)加入每孔中，在37 ℃下培育4 h。隨后，移除培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜。使用自動(dòng)多孔分光光度計(jì)檢測(cè)490 nm處的吸光度(A)值。

3.4細(xì)胞遷移和侵襲能力的測(cè)定 采用放置在24孔板中的含有8 μm膜的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲測(cè)定。獲取轉(zhuǎn)染細(xì)胞并懸浮于無胎牛血清的DMEM中。在細(xì)胞遷移測(cè)定中，向Transwell小室上室加入5×104細(xì)胞，將含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室。培養(yǎng)48 h后，使用棉簽小心地取出未遷移的細(xì)胞。將遷移的細(xì)胞固定、染色并在空氣中干燥。細(xì)胞侵襲檢測(cè)除了用基質(zhì)膠包被Transwell小室以外，其余步驟均與細(xì)胞遷移測(cè)定相似。倒置顯微鏡下拍照。

3.5螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 用TargetScan 6.0(www.targetscan.org/vert_ 60/)預(yù)測(cè)miR-497與靶基因3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)。通過GenePharma合成野生型(pGL3-AKT3-3’UTR Wt)和突變型(pGL3-AKT3-3’UTR Mut)AKT3螢光素酶報(bào)告載體。將HEK293T細(xì)胞以40%～50%的密度接種在24孔板中。培養(yǎng)過夜后，使用Lipofectamine 2000將pGL3-AKT3-3’UTR Wt、 pGL3-AKT3-3’UTR Mut、miR-497模擬物或miR-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后48 h，使用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)。相對(duì)螢光素酶活性用海腎螢光素酶活性進(jìn)行歸一化處理，重復(fù)3次。

3.6Western blot分析 收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，裂解，低溫離心10 min，取上清。10% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)膜，在含5%脫脂奶的TBST中封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的相應(yīng)抗體, 4 ℃下孵育過夜。TBST洗膜3次后，在室溫下用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG孵育2 h，成像。以GAPDH為內(nèi)參照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的方式表示，組間差異采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AKT3是PTC中miR-497的直接靶標(biāo)

螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)野生型AKT3 3’UTR報(bào)告基因的螢光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而突變型報(bào)告基因的螢光素酶活性未受影響。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與miR-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-497 mimics的TPC-1細(xì)胞和HTH83細(xì)胞中AKT3的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),表明AKT3是PTC中miR-497的直接靶基因,見圖1。

Figure 1.The expression of AKT3 at mRNA and protein levels in the TPC-1 cells and HTH83 cells after transfection with miR-497 mimics and miR-NC. A: RT-qPCR was performed to measure the mRNA expression of AKT3 in the TPC-1 cells and HTH83 cells after transfection with miR-497 mimics or miR-NC; B: Western blot was performed to measure the protein expression of AKT3 in the TPC-1 cells and HTH83 cells after transfection with miR-497 mimics or miR-NC. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR-NC group.

2 AKT3與PTC中miR-497的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

與鄰近甲狀腺組織相比，PTC組織中miR-497的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，而AKT3的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05), miR-497和AKT3 mRNA在PTC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.573 7，P<0.01),見圖2。

3 miR-497高表達(dá)抑制PTC的細(xì)胞活力、侵襲和遷移

miR-497模擬物轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞和HTH83細(xì)胞后MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-497的高表達(dá)顯著抑制TPC-1細(xì)胞和HTH83細(xì)胞的活力、侵襲和遷移(P<0.05),見圖3。

4 miR-497通過調(diào)節(jié)AKT3表達(dá)來抑制PTC細(xì)胞的活力、侵襲和遷移

MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC siRNA組相比，敲減AKT3基因表達(dá)后, TPC-1細(xì)胞和HTH83細(xì)胞的活力、遷移和侵襲均受到了抑制，與miR-497的過表達(dá)具有相似作用(P<0.05)，表明miR-497可能通過調(diào)節(jié)AKT3的表達(dá)來部分抑制PTC細(xì)胞的活力、遷移和侵襲，見圖4。

Figure 2.The expression levels of miR-497 and AKT3 mRNA in the PTC tissues. Mean±SD. n=43. *P<0.05 vs adjacent.

Figure 3.The suppressive roles of miR-497 in PTC cell viability, migration and invasion. A: MTT assay was used to evaluate the effect of miR-497 over-expression on the viability in TPC-1 cells and HTH83 cells; B: up-regulation of miR-497 suppressed the migration and invasion abilities of TPC-1 cells and HTH83 cells (×200). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR-NC group.

討 論

越來越多的證據(jù)表明, miR-497在多種人類腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。在乳腺癌中，miR-497的強(qiáng)制表達(dá)通過直接靶向多種基因如Raf-1、CCND1、Bcl-w、CCNE1、Bcl-2和VEGFR2來抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲，血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)可以增加凋亡[12-13];在結(jié)腸直腸癌中，miR-497的上調(diào)可以抑制體外細(xì)胞增殖，減少體內(nèi)外的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，并通過封閉KSR1、IGF-1R和VEGFA來增強(qiáng)5-氟尿嘧啶治療的化學(xué)敏感性[14];在子宮頸癌中，miR-497恢復(fù)表達(dá)可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白

Figure 4.Down-regulation of AKT3 mimicked the roles of miR-497 over-expression in the viability, migration and invasion of PTC cells. A: the viability of TPC-1 cells and HTH83 cells was measured by MTT assay after transfection with AKT3 siRNA or NC siRNA; B: the migration and invasion abilities of TPC-1 cells and HTH83 cells were detected after transfection with AKT3 siRNA or NC siRNA (×200). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NC siRNA group.

E1和IGF-1R來抑制細(xì)胞增殖，集落形成能力和運(yùn)動(dòng)力[15];在肝細(xì)胞癌中，miR-497過表達(dá)通過負(fù)調(diào)節(jié)YAP1、IGF-1R、VEGFA和AEG-1來阻滯細(xì)胞集落形成、增殖、血管生成、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16-17];在非小細(xì)胞肺癌中，miR-497重新表達(dá)通過下調(diào)HDGF，CCNE1，YAP1和VEGFA來減弱細(xì)胞增殖、集落形成、生長(zhǎng)、侵襲和血管生成[18],以上表明miR-497在甲狀腺乳頭狀癌形成和進(jìn)展過程中起著關(guān)鍵作用。

AKT為PI3K/AKT通路的關(guān)鍵因子，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，如細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和代謝[19]。AKT家族成員AKT3已被發(fā)現(xiàn)在多種人類腫瘤中表達(dá)上調(diào)，例如肝細(xì)胞癌、前列腺癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌等[20-22]。Cheng等[23]發(fā)現(xiàn)，AKT3在PTC中被上調(diào)。功能測(cè)定還顯示，AKT3低表達(dá)可以抑制PTC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-497通過直接靶向AKT3來抑制PTC細(xì)胞的活力、侵襲和遷移，說明基于miR-497/AKT3的靶向治療對(duì)PTC來說可能是一種新穎有效的治療策略。

總之，miR-497通過直接靶向AKT3抑制PTC細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲，這種新型的miR-497/AKT3途徑可為PTC提供新的治療方法。