HPLC法測定藏藥西藏棱子芹中阿魏酸的含量

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，重慶 400014；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065

西藏棱子芹為常用藏藥，習(xí)稱藏當(dāng)歸，為傘形科(Umbelliferae) 棱子芹屬(PleurospermumHoffm．) 植物，藥用部位為根和根莖，有清熱解毒的功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)、消化不良等證[1]。收載于《中國藏藥》[2]，在《西藏自治區(qū)藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》[3]第一冊中只有薄層色譜定性鑒別，沒有含量測定。本實(shí)驗(yàn)選用高效液相色譜法為西藏棱子芹中有效成分阿魏酸的含量測定建立了一種分離效率高、穩(wěn)定性好、分析速度快的方法，為控制西藏棱子芹的質(zhì)量提供了可靠的方法。經(jīng)方法學(xué)考察，符合含量測定要求。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2965型 HPLC(美國沃特斯儀器有限公司)；KQ-3200B 型超聲波清洗儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 材料 阿魏酸對照品(批號：110773-201614，中國食品藥品檢定研究院)；西藏棱子芹藥材(批號：1703001、1704002、1709003，西藏甘露制藥有限公司)經(jīng)重慶市中藥研究院生藥室副主任藥師舒抒鑒定為真品；色譜純的甲醇，Ⅰ級水，分析純試劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜條件：Waters C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱；甲醇-1%冰乙酸(40∶60)為流動相；25℃柱溫；318 nm檢測波長[4]；1 mL/min流速；10 μL進(jìn)樣量。在此色譜條件下，阿魏酸與樣品中其它組分分離良好，理論塔板數(shù)按阿魏酸色譜峰計大于4 000。HPLC色譜圖如圖1所示。

2.2 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品，精密稱取0.012 06 g于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得阿魏酸對照品貯備液。將阿魏酸對照品貯備液稀釋10倍，即得阿魏酸對照品溶液的濃度為24.12 μg/mL。

2.3 樣品溶液的制備 取西藏棱子芹藥材，粉碎，過四號篩，取約2 g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加水適量，超聲處理30 min，取出，放置過夜，用水定容至刻度，混勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL于分液漏斗中，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，加乙醚20 mL，提取4次，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，即得樣品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 取阿魏酸對照品溶液(24.12 μg/mL)，分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、12 μL各2次，在上述色譜條件下測定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=5 372 670.30X-56 939.91(r=0.999 9)。結(jié)果：阿魏酸進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系的范圍為0.048 24～0.289 4 μg。

2.5 精密度考察 取阿魏酸對照品溶液，進(jìn)樣量：10 μL；進(jìn)樣次數(shù)：6次，計算阿魏酸的平均峰面積，其RSD值為0.47%(n=6)，結(jié)果儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 取同一樣品(批號201709003)，按樣品溶液制備方法制備，照上述色譜條件，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，每隔2 h 進(jìn)樣1次，測定供試液12 h 的穩(wěn)定性。其RSD值為0.52%。

2.7 重復(fù)性考察 取同一樣品(批號201709003)6份，按樣品溶液制備方方法制備,分別精密吸取10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得RSD值為0.43%。

2.8 加樣回收率考察 取樣品(批號1709003，阿魏酸含量為0.121 0 mg/g)約1 g，精密稱定，共9份，分別精密加入阿魏酸對照品溶液(0.241 2 mg/mL)0.4、0.5、0.6 mL各3份，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，對加樣回收率進(jìn)行計算，平均回收率為98.06 %，其RSD值為1.25%(n=9)。見表1。

表1 阿魏酸加樣回收率的考察

2.7 藥材含量測定 取不同批號的西藏棱子芹藥材約1.0 g，取西藏棱子芹藥材粉(過四號篩)約1.0 g，精密稱定，按樣品溶液制備方法制得樣品溶液，再按上述色譜條件測定峰面積，按外標(biāo)法計算阿魏酸的含量。樣品(批號：1703001、1704002、1709003) 中阿魏酸含量分別為0.179 5、0.168 3、0.121 0 mg/g。與文獻(xiàn)報道[5]基本一致。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 阿魏酸溶于水、乙醇和乙酸乙酯，本試驗(yàn)將上述3種溶劑作為提取溶劑，同等溶劑用量，超聲提取。結(jié)果水的提取效果好，故提取溶劑選用水。

3.2 提取方法的選擇 對樣品進(jìn)行了加水超聲提取和水浴加熱回流提取考察，結(jié)果水浴加熱回流提取與超聲提取差別不大，但超聲提取簡便，故提取方法選用超聲提取。

3.3 流動相的選擇 本試驗(yàn)分別采用了甲醇-0.1%磷酸(50∶50)、甲醇-乙腈-1%冰乙酸(30∶20∶50)、甲醇-水(65∶35)、甲醇-1%冰乙酸(40∶60)和乙腈-水(42∶58)為流動相，結(jié)果表明樣品中阿魏酸以甲醇-1%冰乙酸(40∶60)為流動相時分離度能達(dá)到要求。

3.4 檢測波長的確定 阿魏酸的對照品溶液在波長200～600 nm進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果阿魏酸在318 nm處有最大吸收，故檢測波長確定為318 nm。

西藏棱子芹主要含阿魏酸、甘草查爾酮甲、川陳皮素、異甘草素等化學(xué)成分，試驗(yàn)采用HPLC法測定阿魏酸含量，方法準(zhǔn)確、簡便，重現(xiàn)性好，可作為西藏棱子芹藥材質(zhì)量控制的有效方法。