雷公藤內(nèi)脂醇抑制去勢抵抗性前列腺癌PC3細(xì)胞生長增殖實驗研究

前列腺癌是發(fā)生于男性前列腺組織中的惡性腫瘤，是前列腺腺泡細(xì)胞異常無序生長的結(jié)果。發(fā)病率在歐美地區(qū)較高，亞洲地區(qū)較低[1]。但是，隨著經(jīng)濟(jì)水平和醫(yī)療水平的提高，我國的前列腺癌發(fā)病率也在逐年增長，加之我國人口老齡化的加劇，前列腺癌將成為男性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤。其發(fā)病率隨著年齡的增長而增長，高峰年齡是70～80歲。發(fā)病早期不易被發(fā)現(xiàn)，通常確診時病情已發(fā)展至中晚期，主要癥狀表現(xiàn)為尿血、尿痛及骨痛。目前，中晚期前列腺癌患者的主要治療方法是內(nèi)分泌治療，但經(jīng)過18～24個月的內(nèi)分泌治療后，都會最終進(jìn)展為去勢抵抗性前列腺癌[2-3]。去勢抵抗性前列腺癌是指經(jīng)過初次持續(xù)雄激素剝奪治療后疾病依然進(jìn)展的前列腺癌，該病發(fā)病迅速，死亡率高，大多伴有轉(zhuǎn)移，預(yù)后也較差。目前臨床上多以多西他賽化療法治療去勢抵抗性前列腺癌，有研究表明，多西他賽對患者的預(yù)后有稍微的改善，但并不能延長生存時間，而多西他賽化療法的副作用較大，有的患者無法抵抗加速了死亡。近年來，有研究表明，雷公藤內(nèi)脂醇可以抑制癌細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[4]。在本文的研究中采用從傳統(tǒng)中藥雷公藤中提取的內(nèi)酯化合物作用于去勢抵抗性前列腺癌PC3細(xì)胞，觀察其對PC3細(xì)胞生長增殖的影響。報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

實驗材料是采購于武漢大學(xué)典藏中心的人前列腺癌PC3 細(xì)胞株。雷公藤內(nèi)脂醇采購于美國Sigma公司，用無菌雙蒸水配制為1.0 mg/ml的儲備液，保存在-20°的冰柜內(nèi)備用。新生牛血清、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購于美國BRL Gibco公司。

1.2 實驗方法

細(xì)胞培養(yǎng)：PC3 細(xì)胞株用含10%新生牛血清、青霉素(100 U/L)及鏈霉素(100 U/L) 的 DMEM培養(yǎng)基中，放置在室溫37 ℃、濕度為5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，3～4天傳代1次。

細(xì)胞增殖抑制率測定：用0.25%的胰蛋白酶消化、傳代PC3 細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整其濃度為4×105cells/ml，接種于96孔板，每孔200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)液，加入含不同濃度雷公藤內(nèi)脂醇的培養(yǎng)液100 μL，使其終濃度為5、10、20、40、80、160 nmol/L。設(shè)空白組(有培養(yǎng)液，無細(xì)胞)和對照組(不加藥)，每組5個復(fù)孔，放置在室溫37 ℃、濕度為5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h和48 h后采用MTT法檢測。用ELX800型全自動酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的吸光度值(A)，計算出細(xì)胞生長抑制率，實驗重復(fù)5次，取平均值。細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-實驗組A均數(shù)/對照組A 均數(shù))×100%。

細(xì)胞凋亡檢測：用含有不同濃度雷公藤內(nèi)脂醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)PC3細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，分別收集2×106個細(xì)胞，用PBS洗滌3次后將細(xì)胞充分混勻，再用75%的乙醇固定，4 ℃靜置一夜。用PBS洗去乙醇后加入5 μl Annexin.V液和5 μl PI液，混勻，4 ℃避光染色，15 min后立即應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。

細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF含量的測定：用含有10、20、40 nmol/L終濃度的雷公藤內(nèi)脂醇培養(yǎng)PC3細(xì)胞24 h后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于檢測VEGF的含量。按照試劑盒的說明進(jìn)行操作，將檢測到的不同濃度的VEGF及各組細(xì)胞上清液于Rayto 2 100c酶標(biāo)儀中檢測450nm吸光度(A)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 雷公藤內(nèi)脂醇作用于PC3細(xì)胞后不同時間段形態(tài)的變化

在倒置顯微鏡下可以觀察到，用含有雷公藤內(nèi)脂醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)PC3細(xì)胞后，細(xì)胞的貼壁功能慢慢減退，大部分細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)瓶中，隨著培養(yǎng)時間越來越長，貼壁的部分PC3細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜皺縮、染色質(zhì)濃縮、核膜核仁消失、核固縮、出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象。培養(yǎng)24 h后此現(xiàn)象更加明顯。

2.2 不同濃度雷公藤內(nèi)脂醇在不同時間點對PC3細(xì)胞的生長抑制率

雷公藤內(nèi)脂醇的濃度為5時，培養(yǎng)24 h和48 h的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；雷公藤內(nèi)脂醇濃度為10、20、40 nmol/L時，培養(yǎng)24 h和48 h的抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；雷公藤內(nèi)脂醇的濃度為80、160 nmol/L時，培養(yǎng)24 h和48 h的抑制作用差異，明顯有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度雷公藤內(nèi)脂醇在不同時間點對PC3細(xì)胞的生長抑制率

2.3 不同濃度雷公藤內(nèi)脂醇在不同時間點對PC3細(xì)胞的凋亡情況

對照組(不加藥)在不同時間點對PC3細(xì)胞的凋亡作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；雷公藤內(nèi)脂醇的濃度為10、20、40 nmol/L時，培養(yǎng)PC3細(xì)胞12 h、24 h、48 h后對PC3細(xì)胞的凋亡作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度雷公藤內(nèi)脂醇在不同時間點對PC3細(xì)胞的凋亡情況

2.4 不同濃度雷公藤內(nèi)脂醇對細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF含量的影響

對照組的VEGF含量為(465.48±30.19)%，雷公藤內(nèi)脂醇濃度為10、20、40 nmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF含量分別為(415.24±22.73)%、(323.57±28.26)%、(251.67±32.61)%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同濃度雷公藤內(nèi)脂醇對細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF含量的影響

3 討論

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)中常見的腫瘤，發(fā)病率隨年齡而增長，前列腺癌的發(fā)病率和死亡率僅次于肺癌，位居癌癥死亡的第二位。目前治療前列腺癌的主要方法是內(nèi)分泌治療，但大部分患者經(jīng)過一段時間的治療后進(jìn)展為去勢抵抗性前列腺癌[5-7]。當(dāng)患者發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌時對內(nèi)分泌治療藥物就會失效，對前列腺腫瘤的發(fā)展失去控制，患者的病情愈加惡劣，加速了死亡。因此，尋找新的有效的治療方法已成為當(dāng)務(wù)之急[8-9]。

分子靶向治療作為全新的治療方法在臨床治療癌癥中取得了顯著的療效。分子靶向治療是在細(xì)胞分子水平上，以腫瘤細(xì)胞的特性改變?yōu)樽饔冒悬c，在發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤活性的同時，減少對正常細(xì)胞的毒副作用[10-11]。有研究表明，雷公藤內(nèi)脂醇可以直接作用于癌細(xì)胞的多個分子靶點從而產(chǎn)生抗癌作用[12]。在本文的實驗中，采用中藥雷公藤中提取的內(nèi)酯化合物作用于去勢抵抗性前列腺癌PC3細(xì)胞后，在倒置顯微鏡下可以觀察到PC3細(xì)胞凋亡的結(jié)構(gòu)變化。根據(jù)MTT法檢測計算出的細(xì)胞生長抑制率結(jié)果可知，隨著雷公藤內(nèi)酯醇劑量的增多和培養(yǎng)時間的延長，對PC3細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯。由此可知，雷公藤內(nèi)酯醇可以促進(jìn)PC3細(xì)胞的凋亡，從而抑制癌細(xì)胞的生長增殖。由流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，對照組培養(yǎng)PC3細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率為(0.51±0.33)%，雷公藤內(nèi)脂醇的濃度為10、20、40 nmol/L時，培養(yǎng)PC3細(xì)胞48 h后細(xì)胞的凋亡率分別為(11.25±1.64)%、(27.44±2.97)%、(48.19±2.68)%，明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明隨著雷公藤內(nèi)脂醇濃度的增加，PC3細(xì)胞的凋亡率也隨之升高。當(dāng)雷公藤內(nèi)脂醇的濃度為10 nmol/L時，培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后的凋亡率分別是(7.53±2.14)%、(9.66±2.34)%、(11.25±1.64)%，組內(nèi)比較有差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這就表明相同的雷公藤內(nèi)脂醇濃度對PC3細(xì)胞的凋亡作用隨著時間的延長也隨之提高。由此提示，雷公藤內(nèi)脂醇對PC3細(xì)胞的凋亡呈現(xiàn)出時間與濃度的依賴性。VEGF是與血管生長相關(guān)的因子，它可以刺激腫瘤血管的生長，腫瘤細(xì)胞中VEGF的高表達(dá)，與其腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的含量，就可以達(dá)到抑制腫瘤血管生長的目的[13-15]。根據(jù)實驗結(jié)果可知，含量為10、20、40 nmol/L雷公藤內(nèi)脂醇的細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF含量分別為(415.24±22.73)%、(323.57±28.26)%、(251.67±32.61)%，與對照組(465.48±30.19)%相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明隨著雷公藤內(nèi)脂醇濃度的增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量就越少。由此可知，雷公藤內(nèi)脂醇可以下調(diào)腫瘤細(xì)胞VEGF的含量，抑制腫瘤血管的新生，降低腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。

綜上所述，雷公藤內(nèi)脂醇作用于PC3細(xì)胞后可以下調(diào)腫瘤細(xì)胞VEGF的含量，抑制腫瘤血管的新生，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長增殖。