慢性低壓低氧暴露對小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘形態(tài)及細(xì)絲蛋白A表達(dá)的影響*

周 楊， 趙再華， 沈?qū)W鋒， 駱文靜， 曹子鵬

(第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍隊勞動與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室， 特殊作業(yè)環(huán)境危害評估與防治教育部重點實驗室， 陜西 西安 710032)

高原低壓低氧環(huán)境對人體的影響涉及多個系統(tǒng)和器官，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別是大腦對低氧極為敏感[1-3]。長期處于低壓低氧易出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降，并導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[4]。海馬作為大腦最敏感、最具有可塑性的功能區(qū)，在學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮重要的作用[5]。低壓低氧暴露會影響神經(jīng)元NMDA受體表達(dá)，使海馬神經(jīng)元興奮性降低，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙，但其分子機(jī)制尚不完全明確[6]。樹突棘是神經(jīng)元樹突上的突起結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)具有高度的可塑性，對學(xué)習(xí)記憶功能以及認(rèn)知過程至關(guān)重要[7]。細(xì)絲蛋白A(filamin-A)是高分子質(zhì)量細(xì)胞骨架蛋白細(xì)絲蛋白的亞型結(jié)構(gòu)，可與多種細(xì)胞骨架蛋白和信號蛋白結(jié)合，具有整合細(xì)胞力學(xué)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能[8-9]。本研究通過模擬高原低氧環(huán)境觀察慢性低壓低氧暴露對小鼠樹突棘形態(tài)和細(xì)絲蛋白A表達(dá)的影響，為進(jìn)一步深入了解高原低氧環(huán)境影響認(rèn)知功能的機(jī)制進(jìn)行了探索。

材 料 和 方 法

1 動物分組

C57BL/6雄性小鼠，6～8周齡，起始體質(zhì)量18～20 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，動物許可證編號為SCXK(陜)2014-002。小鼠在本實驗室動物房適宜條件下飼養(yǎng)適應(yīng)4 d后，隨機(jī)分為4組：常氧暴露7 d (normoxia 7 d)組、常氧暴露14 d (normoxia 14 d)組、低壓低氧暴露7 d (hypoxia 7 d)組和低壓低氧暴露14 d (hypoxia 14 d)組，每組20只。

2 主要儀器和試劑

低壓低氧小動物模擬實驗艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司)；VT1000S 振動切片機(jī)(Leica)；CM1900 冰凍切片機(jī)(Leica)；超聲裂解儀(Sonics & Materials)；蛋白電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)；紫外分光光度計(SHIMADZU)；凝膠成像儀(Bio-Rad)；BX51 熒光顯微鏡(Olympus)。FD快速高爾基染色劑(FD Neurotechnologies)；二甲苯(國產(chǎn)分析純)；無水乙醇(國產(chǎn)分析純)；5×Buffer緩沖液、RIPA中效組織裂解液和DAPI染色試劑(上海碧云天)； BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)；Tween-20(Sigma)；化學(xué)發(fā)光試劑(Pierce)；中性樹酯膠和抗β-actin抗體(Sigma)；抗細(xì)絲蛋白A抗體(Cell Signaling Technology)；山羊抗兔IgG(中國康為試劑公司)；PVDF膜(Millipore)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA; MP Biomedicals)；Triton X-100試劑(中國科昊生物公司)。

3 主要方法

3.1低壓低氧暴露小鼠模型 方法同文獻(xiàn)[10]，低壓低氧暴露組小鼠置于低壓低氧小動物模擬實驗艙內(nèi)暴露，期間小鼠自由飲水，正常飼料喂養(yǎng)。模擬海拔高度為6 000米，分別連續(xù)暴露7 d 和14 d。

3.2Golgi染色 小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(10 mL/kg)麻醉后開胸，經(jīng)主動脈灌注37 °C生理鹽水沖洗小鼠體內(nèi)血液，再以4%多聚甲醛灌注至肢體僵硬。取完整腦組織浸泡在高爾基液(A∶B=1∶1)中避光常溫放置2～3周。用振動切片機(jī)經(jīng)海馬區(qū)冠狀位連續(xù)切片(厚100 μm)。切片分別經(jīng)蒸餾水漂洗，高爾基液(D∶E∶蒸餾水=1∶1∶2)浸泡，去離子水再次漂洗，50%、75%、95%和100%無水乙醇依次脫水，最后二甲苯透化，樹膠封片劑封片。

3.3樹突分支及樹突棘密度和長度的測定

3.3.1樹突的分支及長度 在光學(xué)顯微鏡200倍鏡下采集大鼠海馬CA1區(qū)Golgi染色圖片，利用Imaris軟件對單個神經(jīng)元進(jìn)行重構(gòu)和Sholl分析，以神經(jīng)元胞體為圓心，做間距為20 μm的同心圓，統(tǒng)計樹突與同心圓的交點數(shù)之和，用交點總數(shù)反映樹突的分支。

3.3.2樹突棘分類及計數(shù) 在光學(xué)顯微鏡1 000倍鏡下觀察樹突棘，用Imaris軟件對神經(jīng)元樹突棘進(jìn)行重構(gòu)并計數(shù)，以每10 μm樹突棘個數(shù)反映其密度。

3.4Western blot方法 方法同文獻(xiàn)[10]。小鼠麻醉后開胸，生理鹽水經(jīng)主動脈灌注后取腦組織，輕輕剝離海馬置于1.5 mL的EP管中，每1 mg組織10 μL的比例加裂解液。充分研磨組織，靜置樣品于冰上充分裂解15 min，超聲裂解儀進(jìn)一步裂解(時間30 s、振幅25%)，離心(12 500 r/min，15 min)，定量后加入5×SDS樣品緩沖液，煮沸。每組樣品按40 μg蛋白上樣，電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5% BSA室溫封閉2 h，加入I抗4 ℃孵育過夜。次日PBST洗膜，后加相應(yīng)II抗，室溫孵育2 h，再次PBST洗膜后小心滴加化學(xué)發(fā)光試劑，凝膠成像儀成像并觀察拍照，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照(β-actin)積分吸光度(IA)的比值表示蛋白的相對表達(dá)量。

3.5免疫熒光染色 小鼠麻醉后開胸，生理鹽水經(jīng)主動脈灌注，4%多聚甲醛灌注至肢體僵硬后取完整腦組織。蔗糖溶液梯度脫水2～3 d，冰凍切片機(jī)經(jīng)海馬區(qū)冠狀位連續(xù)切片(厚20 μm)，晾干(室溫2 h)后PBS洗片3次,每次5 min，5% BSA(含0.3% Triton X-100)溶液室溫封閉透化30 min，將 I 抗用1% BSA溶液稀釋(1∶100)，滴加在封閉好的玻片上，放入濕盒中4 °C過夜。次日用PBS洗片3次,每次5 min，將熒光 II 抗用1% BSA溶液稀釋(1∶500)，小心滴加在玻片上，室溫下避光孵育2 h，PBS洗片3次,每次5 min，加入DAPI試劑染胞核，室溫下避光30 min，PBS洗片3次,每次5 min，70%甘油避光封片，晾干后在熒光顯微鏡下觀察和拍照。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用t檢驗進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用GraphPad Prism 5軟件作圖。

結(jié) 果

1 慢性低壓低氧暴露后海馬CA1區(qū)樹突分支的變化

神經(jīng)元樹突分支在接受信息傳入和反饋回路形成中起著重要作用[11]。我們采用Golgi染色法觀察慢性低壓低氧暴露對小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突分支的影響，并用Imaris軟件對神經(jīng)元進(jìn)行分析計數(shù)，結(jié)果顯示,與常氧暴露組相比，低壓低氧暴露7 d與14 d后小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突分支數(shù)略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖1。

Figure 1.Effect of hypobaric hypoxia exposure on branches of dendrites in the neurons of mouse hippocampal CA1 region. A: Golgi staining of mouse hippocampus (scale bar=100 μm); B: Golgi staining of mouse pyramidal neurons in hippocampus CA1 region (scale bar=50 μm); C: total number of intersection points of dendrites in hippocampal CA1 region after 7 d and 14 d of exposure. Mean±SD. n=6.

2 慢性低壓低氧暴露后海馬CA1區(qū)樹突棘密度及長度的變化

為了進(jìn)一步探討低壓低氧暴露對神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)的影響，將Golgi染色片在顯微鏡下觀察，采用Imaris軟件采集神經(jīng)元樹突棘圖片并進(jìn)行分析統(tǒng)計。結(jié)果顯示，與常氧暴露組相比，低壓低氧暴露7 d 與14 d后小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元基樹突棘和頂樹突棘的密度均顯著減少(P<0.01)，并且樹突棘長度增加(P<0.05),見圖2。

3 慢性低壓低氧暴露后海馬組織細(xì)絲蛋白A表達(dá)的變化

通過Western blot法檢測低壓低氧暴露后小鼠海馬區(qū)細(xì)絲蛋白A的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,低壓低氧暴露7 d和14 d后，小鼠海馬組織細(xì)絲蛋白A的蛋白表達(dá)水平低于常氧暴露組(P<0.01或P<0.05)。與低壓低氧暴露7 d 組相比，暴露14 d 組細(xì)絲蛋白A表達(dá)水平升高(P<0.05)，表明隨著低壓低氧暴露時間延長，細(xì)絲蛋白A的表達(dá)水平有一定程度的恢復(fù),見圖3。

Figure 2.Effect of hypobaric hypoxia exposure on dendritic spine density and length in the neurons of mouse hippocampal CA1 neurons. A: basal dendrites and dentritic spines (Golgi staining, ×1 000, scale bar=10 μm); B: apical dendrites and dentritic spines (Golgi staining, ×1 000, scale bar=5 μm). Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs normoxia group.

4 慢性低壓低氧暴露后海馬CA1區(qū)細(xì)絲蛋白A表達(dá)和分布的變化

為了明確低壓低氧暴露對海馬CA1區(qū)細(xì)絲蛋白A表達(dá)和分布的變化，采用免疫組織熒光染色法檢測低壓低氧暴露后小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)絲蛋白A表達(dá)和分布。結(jié)果顯示,細(xì)絲蛋白A在小鼠海馬CA1區(qū)有正常表達(dá)，低壓低氧暴露7 d 和14 d 后表達(dá)水平低于常氧暴露組(P<0.05)。與低壓低氧暴露7 d組相比，暴露14 d 組細(xì)絲蛋白A表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，這可能是由于免疫組織熒光染色實驗中固定切片引起少部分抗原被封閉，導(dǎo)致檢測的敏感性下降[12],見圖4。

Figure 3.The effects of hypobaric hypoxia exposure on expression of filamin-A in mouse hippocampus. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs normoxia group; #P<0.05 vs hypoxia 7 d group.

Figure 4.The distribution of filamin-A in mouse hippocampal CA1 region. The scale bars are 100 μm in the upper pannel and 20 μm in the lower panel. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs normoxia group.

討 論

研究表明，慢性高原低氧可以影響大/小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[13-14]。缺氧對不同部位的腦神經(jīng)有不同的敏感性，其中海馬CA1錐體神經(jīng)元、皮層神經(jīng)元、丘腦網(wǎng)狀神經(jīng)元和腦干神經(jīng)元更易受到缺氧的干擾，這些神經(jīng)元被稱為“缺氧易感細(xì)胞(anoxia-prone cells)”[15-16]。而工作記憶功能易發(fā)生慢性損傷主要是由于海馬椎體CA1細(xì)胞對低氧有極高的敏感性。目前對低壓低氧環(huán)境暴露對大腦認(rèn)知功能影響的研究多局限于功能可塑性以及學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)測試，關(guān)于結(jié)構(gòu)可塑性的研究較少。樹突棘作為神經(jīng)元樹突的重要特征性結(jié)構(gòu)，其形態(tài)的動態(tài)變化對神經(jīng)元信息傳遞和接收有重要的意義[17-18]。本研究采用Golgi染色方法觀察小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)改變，結(jié)果表明慢性低壓低氧暴露對神經(jīng)元交叉點數(shù)目無顯著影響，但低壓低氧暴露后CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度下降，長度增加。Segura等[19]利用原代培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元觀察低氧暴露對神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)低氧暴露后樹突棘密度降低，長度增加，且無膨突偽足狀樹突棘比例增加。由此可見，低氧暴露可導(dǎo)致小鼠海馬神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)的改變，提示樹突棘結(jié)構(gòu)改變可能與低氧暴露導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能損傷有關(guān)。

細(xì)絲蛋白A是細(xì)胞骨架蛋白細(xì)絲蛋白的亞型結(jié)構(gòu)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，參與維持神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)和功能[20]。以往研究表明細(xì)絲蛋白A參與樹突形態(tài)發(fā)生[21]，軸突生長錐形成[22]和神經(jīng)元遷移[23]。在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中，改變細(xì)絲蛋白A表達(dá)水平可影響樹突棘的結(jié)構(gòu)[19]。本研究通過Western blot和免疫組織熒光染色方法檢測慢性低壓低氧暴露對小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)絲蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示慢性低氧暴露導(dǎo)致細(xì)絲蛋白A表達(dá)降低，說明細(xì)絲蛋白A可能與低氧暴露引起海馬CA1區(qū)樹突棘結(jié)構(gòu)損傷的過程有關(guān)，是低氧損傷學(xué)習(xí)記憶功能的分子機(jī)制之一。Western blot結(jié)果顯示，低壓低氧暴露14 d 后細(xì)絲蛋白A表達(dá)水平有一定程度恢復(fù)，而此時海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘的密度和長度與暴露7 d 組無明顯差異，因此推測可能還有其它分子參與了低壓低氧暴露導(dǎo)致的樹突棘結(jié)構(gòu)改變。以上結(jié)果提示，需進(jìn)一步深入研究樹突棘結(jié)構(gòu)改變在低壓低氧致學(xué)習(xí)記憶功能改變中的確切作用及其分子機(jī)制。

綜上所述，慢性低壓低氧暴露可導(dǎo)致小鼠海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元樹突棘結(jié)構(gòu)改變，密度降低且長度增加，并影響CA1區(qū)細(xì)絲蛋白A的正常表達(dá)，提示細(xì)絲蛋白A表達(dá)降低可能與慢性低壓低氧暴露影響CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響小鼠學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)。