膽囊癌組織中p57KIP2、cyclin D1和cyclin E的表達及臨床意義

羅祖強，莊志泉，涂曉萌

1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325000；

2.溫州醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院醫(yī)學影像學系，浙江 溫州 325000；

3.溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院中心實驗室，浙江 溫州 325000

原發(fā)性膽囊癌（primary carcinoma of the gallbladder，PCG）是指發(fā)生于膽囊底部、體部及頸部的惡性腫瘤。PCG由奧地利學者Stoll在1777年發(fā)現(xiàn)，該腫瘤是肝膽外科較常見的膽道惡性腫瘤，居膽道惡性腫瘤首位，居消化道腫瘤第5～6位［1］。PCG的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，在我國PCG的發(fā)病率己成為中國發(fā)病率增長較快的幾種腫瘤之一［2］。從病理學角度來看，大多數(shù)的PCG為腺癌，男女比例約1∶3，由于PCG臨床經(jīng)過較為隱秘，大多數(shù)患者確診時多數(shù)已進展至晚期，5年生存率不足5%［3-5］。尋找有效的早期診斷及判斷PCG預后的方法已成為研究PCG的熱點。眾所周知，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子家族(cyclin-dependent kinase inhibitors，CKIs)發(fā)揮負向調(diào)控細胞周期的作用，p57KIP2是最新發(fā)現(xiàn)的一個成員。本研究收集有完整資料的PCG患者，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）、免疫組織化學方法分別檢測PCG、膽囊腺瘤（adenoma of the gallbladder，AG）和慢性膽囊炎（chronic cholecystitis，CC）組織中p57KIP2、cyclin D1、cyclin E mRNA及蛋白的表達并探討其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 標本來源

收集溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科2006年1月—2016年12月存檔的PCG標本60例，年齡25～75歲，中位年齡53歲。按美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）癌癥分期手冊（7版）［6］對PCG進行TNM分期：I期15例，Ⅱ期21例，Ⅲ+Ⅳ期24例；按WHO標準（2003版）對PCG進行組織學分級：I級13例，Ⅱ級29例，Ⅲ級18例。留取新鮮組織存入液氮中備用，所有組織在固定后做石蠟包埋并切4 μm厚度的切片。同時收集AG 20例和CC 20例作為對照組。

1.2 試劑

PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。鼠抗人p57KIP2抗體、兔抗人cyclin D1抗體、兔抗人cyclin E抗體及其他配套試劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。3種抗體的工作濃度分別為1∶150、1∶250和1∶200。

1.3 方法

1.3.1 RTFQ-PCR檢測p57KIP2、cyclin D1及cyclin E mRNA的表達情況

β-actin上游引物：5'-CTGGGACGACATGG ACAAAA-3'，下游引物：3'-AAGGAAGGC T G G A A G A G T G C-5'。 p 5 7KIP2上 游 引物：5'-A A C C C G A C G C A G A A G A G TC-3'，下游引物：3'-AGAGGAGAGGA CAGCGAGAAG-5'。Cyclin D1上游引物：5'-AGGAGAACAAACAGATCA-3'，下游引物：3'-TAGGACAGGAAGTTGTTG-5'。Cyclin E上游引物：5'-TTCTTGAGCAACACCCTC-3'，下游引物：3'-CGCATACACTGTCTACCT-5'。用TRIzol提取組織總RNA，取1 μg的總RNA反轉(zhuǎn)錄，條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。p57KIP2的PCR條件為：95 ℃ 預變性2 min，95 ℃ 變性45 s，63 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)。Cyclin D1的PCR條件為：95 ℃ 預變性2 min，95 ℃ 變性45 s，61 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，共40個循環(huán)。Cyclin E的PCR條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)。取10 μL擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，PCR的擴增長度應為180（β-actin）、220（p57KIP2）、163（cyclin D1）和260 bp（cyclin E）。

1.3.2 免疫組織化學檢測p57KIP2、cyclin D1及cyclin E蛋白水平

按實驗說明書進行EliVision法染色，以PBS代替一抗為陰性對照，用已知陽性的切片作陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷

1.4.1 RTFQ-PCR結(jié)果判定

用BioRad Gel-2000圖像分析儀進行光密度分析，以每個標本的目的條帶測定值與β-actin測定值的比值，表示該標本目的基因的相對表達水平。

1.4.2 免疫組織化學結(jié)果判定

兩名病理醫(yī)師采用雙盲法對染色結(jié)果進行判斷，p57KIP2、cyclin D1及cyclin E以細胞核呈褐色或黃色為陽性細胞。未見陽性細胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，褐色為3分。陽性細胞百分比與著色強度相加，（-）示0～1，（+）示2分，（++）示3～4分，（+++）示＞5分，其中（+）～（+++）為陽性，（-）為陰性。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料比較采用方差分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗及Spearman相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 RTFQ-PCR檢測p57KIP2、cyclin D1及cyclin E mRNA在PCG、AG和CC組織中的表達

p57KIP2mRNA在PCG、AG和CC中的表達逐漸升高，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Cyclin D1和cyclin E mRNA在PCG、AG和CC中的表達逐漸降低，PCG與AG比較、PCG與CC比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。

2.2 免疫組織化學檢測p57KIP2、cyclin D1及cyclin E蛋白在PCG、AG和CC組織中的水平

p57KIP2蛋白在PCG、AG和CC中的表達逐漸升高，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2、圖1A、B）。Cyclin D1和cyclin E蛋白在PCG、AG和CC中的表達逐漸降低，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2，圖1C、D）。

表 1 p57KIP2, cyclin D1及cyclin E mRNA在PCG、AG和CC中的表達Tab. 1 mRNA expressions of p57KIP2, cyclin D1 and cyclin E in PCG, AG and CC(±s)

表 1 p57KIP2, cyclin D1及cyclin E mRNA在PCG、AG和CC中的表達Tab. 1 mRNA expressions of p57KIP2, cyclin D1 and cyclin E in PCG, AG and CC(±s)

★: P＜0.05, compared with three groups; ▲: P＜0.05, compared with PCG; ●: P＜0.05, compared with AG

Group n p57KIP2 mRNA P value Cyclin D1 mRNA P value Cyclin E mRNA P value PCG 60 0.24±0.03 0.030★ 0.90±0.03 0.028★ 0.74±0.05 0.047★AG 20 0.49±0.01 0.025▲ 0.38±0.02 0.046▲ 0.41±0.03 0.049▲CC 20 0.81±0.04 0.016▲● 0.29±0.02 0.033▲ 0.22±0.01 0.024▲

表 2 p57KIP2，cyclin D1及cyclin E蛋白在PCG、AG和CC中的水平Tab. 2 Protein levels of p57KIP2, cyclin D1 and cyclin E in PCG, AG and CC

圖 1 p57KIP2、cyclin D1及cyclin E蛋白在PCG和CC中的水平Fig. 1 Protein levels of p57KIP2, cyclin D1 and cyclin E in PCG and CC

2.3 p57KIP2、cyclin D1和cyclin E蛋白水平與PCG臨床病理特征的關系

在PCG組織中，p57KIP2、cyclin D1和cyclin E蛋白水平與年齡、腫塊大小無關（P＞0.05）。p57KIP2蛋白水平與臨床分期、組織學分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關（P＜0.05）。Cyclin D1蛋白水平與臨床分期有關（P＜0.05），與組織學分級無關（P＞0.05）。Cyclin E蛋白水平與臨床分期、組織學分級無關（P＞0.05，表3）。

表 3 p57KIP2、cyclin D1及cyclin E蛋白在PCG組織中水平與臨床病理特征的關系Tab. 3 Relationship between protein levels of p57KIP2, cyclin D1 and cyclin E in PCG and clinicopathological characteristics

2.4 PCG組織中p57KIP2、cyclin D1及cyclin E蛋白水平的相關性

在PCG中，p57KIP2與cyclin D1的表達呈負相關（χ2=22.143，r=-0.684，P＜0.05）；p57KIP2與cyclin E的表達呈負相關（χ2=21.159，r=-0.475，P＜0.05）；Cyclin D1與cyclin E的表達呈正相關（χ2=9.637，r=0.362，P＜0.05）。

3 討 論

在細胞有絲分裂過程中，G1到S期有一個限制點，此限制點限制細胞的分裂。p57KIP2是CIP/KIP家族的成員，能阻滯細胞周期通過這個限制點，從而抑制細胞增殖［7-8］。Zhao等［9］的研究顯示，抑制乳腺癌細胞中p57KIP2基因的表達，能促進腫瘤細胞的增殖、侵襲能力。Ru等［10］運用免疫組織化學及PCR方法檢測顯示，p57KIP2mRNA、蛋白在胃腺癌組織中的表達比正常胃組織低，p57KIP2的表達與胃癌的預后有關。本研究結(jié)果顯示，p57KIP2mRNA及蛋白在PCG、AG和CC中的表達逐漸升高，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與上述研究的結(jié)果相似。提示正常膽囊組織惡變過程中p57KIP2表達在衰減，從而失去對細胞增殖的負向調(diào)控作用。在PCG不同分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的檢測中p57KIP2的表達差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），提示PCG中p57KIP2可能解除了對細胞生長的抑制，導致細胞無限增殖。因此，p57KIP2在PCG中的檢測可作為患者預后的參考指標。

G1期細胞增殖信號的關鍵蛋白cyclin D1蛋白包含295個氨基酸殘基，cyclin D1與CDK4結(jié)合，使包括Rb在內(nèi)的底物磷酸化，促進細胞越過G1/S限制點。Cyclin E蛋白包含395個氨基酸殘基，cyclin E與CDK2結(jié)合，使包括Rb在內(nèi)的底物磷酸化，導致細胞從G1晚期進入S期。Doval等［11］研究發(fā)現(xiàn)，cyclin D1在PCG中高表達，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、高組織學分級組表達更高，cyclin D1是PCG預后的指標之一。張桂東［12］通過RTFQPCR研究cyclin D1 mRNA在PCG與CC中的表達情況，結(jié)果顯示，cyclin D1 mRNA在PCG組織中的表達高于CC組織，但與組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關。Mishra等［13］應用免疫組織化學檢測了40例PCG組織和6例AG織中cyclin E的表情況，結(jié)果顯示，cyclin E在PCG中表達更高，cyclin E高表達可作為預測膽囊惡性腫瘤侵犯行為的生物標志物。本研究結(jié)果顯示，cyclin D1、cyclin E mRNA及蛋白在PCG、AG和CC中的表達逐漸降低（P＜0.05）。在PCG組織中，cyclin D1蛋白的表達與臨床分期有關（P＜0.05），與組織學分級無關（P＞0.05）。Cyclin E蛋白的表達與臨床分期、組織學分級無關（P＞0.05），與上述研究的結(jié)果相似。對cyclin D1與cyclin E的相關性分析發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關（P＜0.05），提示cyclin D1、cyclin E高表達能促進PCG細胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，促進PCG的發(fā)生、發(fā)展，是PCG惡性轉(zhuǎn)變的重要標志。

細胞周期調(diào)控是十分復雜的，而腫瘤的產(chǎn)生是多種因素作用的結(jié)果。細胞周期的調(diào)控中CDKI與cyclin、CDK相互拮抗又相互聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，p57KIP2在CC中表達最高，cyclin D1、cyclin E在CC中表達最低，p57KIP2與cyclin D1及cyclin E呈負相關，cyclin D1與cyclin E呈正相關。提示轉(zhuǎn)錄、翻譯中p57KIP2高表達，cyclin D1及cyclin E低表達是膽囊細胞保持正常沉默狀態(tài)所必需的前提條件。p57KIP2蛋白與cyclin D1、cyclin E-CDK4復合物結(jié)合，抑制Rb蛋白的磷酸化，抑制細胞的分裂。PCG形成中可能由于p57KIP2基因活性下調(diào)，使p57KIP2蛋白表達降低，cyclin D1和cyclin E基因活性上調(diào)，使cyclin D1、cyclin E蛋白水平升高，削弱了p57KIP2抑制cyclin D1、cyclin E的作用，促使腫瘤形成。

綜上所述，p57KIP2表達的降低與cyclin D1、cyclin E表達的增加可能是PCG發(fā)生機制之一；檢測p57KIP2、cyclin D1及cyclin E對PCG的預后判斷有重要意義。