大青葉抗胸膜肺炎放線桿菌活性部位的初步分離

陽剛　白璐　李正文

摘要：提取分離大青葉并測定各級提取物對豬胸膜肺炎放線桿菌的抑菌活性。采用二倍稀釋法測定最小抑菌濃度（Minimal inhibitoryconcentration，MIC）和最小殺菌濃度（Minimal bactericidal concentration，MBC）以追蹤大青葉的活性部位及其活性成分。采用80%的乙醇提取并通過硅膠柱色譜法對其進一步分離，測定抑菌活性，追蹤其活性段。同時以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、水依次提取，測定抑菌活性，并對提取物的化學(xué)成分進行初步分析。硅膠柱色譜各分離組分對試驗菌均有不同程度的抑制作用，抑菌效果最好的為組分3，其MIC為3.91 mg/mL。各級提取物中抑菌活性較好的為乙酸乙酯提取物，其MIC為3.91 mg/mL。其抑制胸膜肺炎放線桿菌生長的主要成分可能為生物堿、有機酸和黃酮類物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：大青葉；硅膠柱色譜；系統(tǒng)溶劑提取；抑菌活性；成分分析

中圖分類號：S852.6 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2018）10-0007-04

大青葉是十字花科植物菘藍（Isatis indigotica Fort.）的干燥葉，具有清熱、解毒、涼血、止血等功效，用于治療熱毒發(fā)斑、丹毒、咽喉腫痛、口舌生瘡、瘡癰腫毒等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有廣泛的抗菌作用，對革蘭氏陰性和陽性菌具有較好的效果[1-3]。目前關(guān)于大青葉抑菌活性的報道集中在其各級提取物，缺少對其抑菌成分的進一步研究[4]。本試驗通過不同提取分離方法，以豬胸膜放線桿菌為試驗菌，采用二倍稀釋法測定最小抑菌濃度（Minimal inhibitoryconcentration，MIC）和最小殺菌濃度（Minimal bactericidal concentration，MBC），追蹤其抑菌的活性部位或活性成分，為進一步分離大青葉中抗胸膜肺炎放線桿菌活性物質(zhì)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大青葉（產(chǎn)地河北）購置于四川雅安惠民堂藥業(yè)連鎖有限責(zé)任公司。豬胸膜肺炎放線桿菌購買于中國獸藥監(jiān)察所，編號為ATCC 265。

1.2 主要試劑及儀器

氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、二甲亞砜等有機試劑，均為分析純，購于成都市科龍化工試劑廠。茚三酮、碘化鉍鉀、硅鎢酸、三氯化鐵、三氯化鋁、濃硫酸、濃鹽酸、溴甲酚綠、醋酸鎂、鹽酸羥胺、4-氨基安替比林、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、明膠、氫氧化鈉、氫氧化鉀等分析試劑。電熱套，電子天平，滅菌鍋，索氏提取器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.3 培養(yǎng)基

含0.02% NAD的TSB和含0.02% NAD的TSA。

1.4 方法

1.4.1 大青葉80%乙醇提取 準確稱定100 g大青葉粉末，80%乙醇，60 ℃索氏回流提取，料液比1∶10，每次8 h，共3次，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇味，25 ℃下避光干燥至浸膏狀備用，并計算提取率。

（1）大青葉薄層條件的篩選。經(jīng)過篩選，甲苯-氯仿-丙酮（5∶5∶4）有較好的分離效果。

（2）大青葉的硅膠色譜分離。100～200目硅膠共600 g，5 g浸膏以200～300目硅膠拌樣，真空干燥，干法上樣，以甲苯-氯仿-丙酮（5∶5∶4）梯度洗脫，每25 mL收集一次。根據(jù)TCL檢測合并相同組分，得到5個組分。

1.4.2 系統(tǒng)溶劑法提取 準確稱量100 g大青葉粉末，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和水，4 ℃提取，每次8 h，相同溶劑每次重復(fù)3次，合并相同組分；合并后的萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無有機溶劑味，25 ℃下避光干燥至浸膏狀備用，并計算提取率。

1.4.3 抑菌效果的測定

（1）菌懸液的制備。將胸膜放線桿菌接種到含0.02%的TSA培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)好后挑選單個菌落，接種于無菌試管中，涂板計數(shù)，以無菌蒸餾水稀釋至106 CFU/mL備用。

（2）最小抑菌濃度的測定。將各提取部分以二甲亞砜溶解，配置成一定濃度的溶液。96孔板，無菌操作，首先在每排1～10孔內(nèi)分別依次加入含0.02% NAD的TSB液體100 μL，然后再每排第一孔再加入100 μL藥液，混合均勻后取100 μL到第2孔，依次混合稀釋直至第10孔。完成上述操作后，取制備好的細菌，向每孔加入100 μL菌液（106 CFU/mL），使菌液濃度最終為5×105 CFU/mL。第11孔為陰性對照（100 μL含0.02%NAD的TSB和100 μL藥液），12孔為陽性對照（100 μL含0.02%NAD的TSB和100 μL菌液），另取一孔作為空白對照（100 μL含0.02%NAD的TSB和100 μL二甲亞砜），各組分平行3次?；靹?，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。在陽性對照組溶液渾濁，陰性對照組溶液澄清的情況下，且在二甲亞砜沒有抑制胸膜放線桿菌生長的濃度下，與對照組比較，試驗組眼觀溶液澄清、顏色未發(fā)生變化的最低藥物濃度則作為該藥的MIC。

（3）最小殺菌濃度的測定。試驗組澄清的各孔中液體接種涂布于TSA固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察有無細菌生長。平皿培養(yǎng)基中計數(shù)少于5個菌落，該藥物濃度值為其MBC值[5]。

1.4.4 各級提取物成分的初步分析 將各級提取物按照天然藥物化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試驗方法，對其成分進行初步分析[6，7]。化合物定性鑒定標準見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 80%乙醇提取物體外抑菌效果

大青葉80%乙醇提取物及其硅膠色譜各分離組分的體外抑菌效果見表2。由表2可知，各分離產(chǎn)物對豬胸膜放線桿菌均有較好的抑制作用，其分離產(chǎn)物中的3和4兩個組分有很強的抑菌效果，其MIC分別為3.91、7.82 mg/mL，其MBC值分別為7.82、15.63 mg/mL。其次分離組分1、組分2、組分5的MIC值均為31.25 mg/mL。

2.2 系統(tǒng)溶劑提取法提取物的體外抑菌效果

大青葉系統(tǒng)溶劑提取法提取產(chǎn)物的體外抑菌效果見表3。由表3可知，各組分對豬胸膜放線桿菌均有較強的抑制效果。其中以乙酸乙酯提取物的抑菌能力最好，其MIC為3.91 mg/mL，MBC也較其他組分低，為7.82 mg/mL，其次為丙酮提取物，其MIC為7.82 mg/mL。氯仿提取物MIC為15.63 mg/mL，石油醚和甲醇提取物抑菌效果較差，為31.25 mg/mL。大青葉的水提物的MIC為62.50 mg/mL。

2.3 大青葉系統(tǒng)溶劑提取的各級提取物定性試驗結(jié)果

為了初步判斷抑菌活性部位的成分，對其成分進行了初步定性分析。大青葉系統(tǒng)溶劑法各級提取物的定性試驗結(jié)果見表4。由表4可初步判斷，石油醚提取物中主要含有油脂和甾體成分。氯仿提取物中主要存在黃酮類、有機酸、油脂。乙酸乙酯和丙酮提取物中主要存在生物堿、黃酮類和有機酸。甲醇和水提取物中含有氨基酸、糖類及黃酮類物質(zhì)。水提取物還含有皂苷。

3 討論

豬胸膜放線桿菌主要引起以急性胸膜肺炎為特征的呼吸道傳染性疾病，是臨床上的常見疾病，給養(yǎng)殖業(yè)造成的危害巨大[6，7]。臨床多用青霉素、四環(huán)素、磺胺類藥物治療。唐萬勇等[8]研究氟苯尼考、多西環(huán)素、TMP和黏桿菌素對胸膜肺炎放線桿菌的體外抑菌效果，結(jié)果表明抑菌效果顯著。但長期使用抗生素不僅會造成細菌耐藥性增加也會使抗生素在動物體內(nèi)殘留，進而威脅人類健康[9，10]。我國中藥資源豐富，從傳統(tǒng)中藥材中找到抗生素的代替品，避免細菌對抗生素的長期耐藥，緩解抗生素短缺是目前研究的熱點[11，12]。劉仁志等[13]研究表明大蒜揮發(fā)油和廣藿香揮發(fā)油的復(fù)方制劑對豬胸膜肺炎放線桿菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度分別為3.9 mg/mL和7.8 mg/mL?？祹浀萚14]通過對烏梅等20種中藥對豬胸膜肺炎放線桿菌的體外抑菌活性試驗篩選，發(fā)現(xiàn)大青葉80%乙醇提取物對胸膜肺炎放線桿菌有較好抑制效果。大青葉作為傳統(tǒng)純天然藥物，其毒性低、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有較為明顯的效果，是藥物開發(fā)的理想對象[15]。本試驗對大青葉80%乙醇索氏回流提取物進行層析分離，進一步追蹤其活性部位。硅膠柱色譜法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，首先洗脫下來的是極性較小的組分。通過層析分離，在得到的組分中，抑菌活性較好的部分為3、4兩個組分，其MIC分別為3.91 mg/mL和7.82 mg/mL。然而，硅膠柱色譜法進行分離由于溫度、上樣量、流速和其他人為因素的影響，不利于進一步的分離工作[16]。因此改用系統(tǒng)溶劑提取法對其抑菌活性部位進行追蹤并對其成分進行初步的定性分析。試驗表明石油醚提取物抑菌性能相對不強，而大青葉的各級提取物中乙酸乙酯提取物對豬胸膜放線桿菌有很強的抑制作用，為3.91 mg/mL。丙酮提取物也有很好的效果，其MIC為7.82 mg/mL。說明大青葉中的抗菌有效成分主要在乙酸乙酯等中大極性的溶液當中。這可能與乙酸乙酯與丙酮極性較為相近，其提取的產(chǎn)物相近有關(guān)。通過初步定性分析，其抗菌有效成分可能為生物堿和黃酮類成分。生物堿及黃酮類化合物資源豐富，抗菌譜廣，對包括耐藥菌在內(nèi)的菌株具有良好的抗菌效果[17，18]。劉軍鋒等[19]采用抑菌圈法測定了苦參堿等5種生物堿對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抗菌活性，結(jié)果表明5種生物堿對3種細菌生長均具有顯著的抑制作用?；磴y強等[20]發(fā)現(xiàn)銀杏葉黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抗菌作用。研究表明，生物堿及黃酮類化合物抗菌作用機制可能與菌體細胞壁、細胞膜的破壞及膜通透性的改變、相關(guān)酶和外排泵的抑制、影響菌體DNA和相關(guān)蛋白合成等多個方面有關(guān)[21，22]。大青葉對豬胸膜肺炎防線桿菌的抗菌機制還有待進一步研究。

4 小結(jié)

試驗對大青葉的各級提取物對豬胸膜放線桿菌體外抑菌活性進行研究，證明了大青葉對豬胸膜放線桿菌有較高抑菌活性的部位在乙酸乙酯和丙酮提取部位，通過初步定性分析，其抗菌有效成分可能為生物堿和黃酮類成分，為進一步分離大青葉抗胸膜肺炎放線桿菌奠定了基礎(chǔ)。

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