熒光定量PCR輻照食品鑒定技術的優(yōu)化研究

劉綿學 伏毅 鄭宇 王艷 潘琳 李華 黃敏

（1. 四川省原子能研究院輻照保藏四川省重點實驗室，成都 610101；2. 四川省原子能研究院生物技術研究所，成都 610101）

輻照食品鑒定是指通過物理、化學及生物原理［1］對食品是否接受輻照，以及評估其接受的輻照劑量的技術方法［2］，其應用領域為食品衛(wèi)生監(jiān)督部門及檢驗檢疫部門等［4-5］。根據Akram等［3］描述，一種理想的輻照鑒定技術，需要在輻照或其它方式處理后的細微變化中，提供輻照專屬的、敏感的、可重復的、具有劑量相關性且穩(wěn)定的檢測結果。由于輻照處理通常會造成細胞DNA的雙鏈斷裂現(xiàn)象（Double strand break，DSB）［7］，基于DSB識別的輻照鑒定方法稱為“DNA變異法”［8］。近年來研究者將熒光定量PCR（Realtime PCR）方法引入輻照鑒定［9-11］，通過完整模板留存量鑒定輻照導致的DNA分子損傷，具體方法為通過持家基因（House-keeping gene，HK）引物的初始循環(huán)數變化值來評估輻照劑量。該技術初期用于輻照食品中的有害微生物（金黃色葡萄球菌［12］、沙門氏菌［13］和創(chuàng)傷弧菌［11］）的滅菌效果驗證，因發(fā)現(xiàn)輻照劑量和檢測結果存在相關性［12］，開始用于海魚的輻照鑒定工作［14］。相較于現(xiàn)行國標“彗星DNA法”，其優(yōu)勢在于檢測位點數量級增加，可進行輻照劑量評估。盡管如此，該方法仍存在不足之處：（1）無假陽性樣本鑒別功能；（2）不同樣本之間若DNA模板加入量存在差異，會干擾初始循環(huán)數與輻照劑量之間的對應關系。綜上，輻照鑒定中熒光定量PCR技術具有較好的發(fā)展?jié)摿?，但需要更好的方法?yōu)化。

引物對應序列分布數是決定熒光定量PCR檢測效果的重要因素之一［13］，分布數越高，檢測靈敏度越高。已有報道［15］植物基因組中逆轉座子分子標記的重復性和特異性優(yōu)于簡單序列重復間區(qū)域（inter-simple sequence repeat，ISSR）和隨機擴增多態(tài)性DNA分子標記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD），但尚無將其應用于輻照鑒定技術的報道。本研究將長末端重復序列（Long terminal repeat，LTR）反轉錄轉座子（Transposable Elements，TE）引物引入熒光定量PCR輻照鑒定方法，擬獲得以下優(yōu)化效果：提供假陽性樣本甄別能力，減少因初始模板量差異導致的結果干擾，強化劑量標準曲線的線性關系。為達到以上目標，本研究以馬鈴薯（Solanum tuberosum）切片為實驗材料，通過多引物體系篩選、轉座子狀態(tài)分析、DNA損傷特征分析和劑量回歸分析等方法，探究TE引物應用及方法優(yōu)化對該鑒定方法的優(yōu)化效果。該輻照鑒定方法的構建與優(yōu)化，對輻照食品監(jiān)管及檢驗檢疫相關領域具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇四川新鮮馬鈴薯作為實驗材料。挑選100-200 g塊莖洗凈，統(tǒng)一切為半圓形切片（厚度約5 mm），使用透明PE食品袋真空封裝。DNA提取使用 OMEGA 公司 HP Plant DNA Kit（D2485-01）。定量PCR預混液購自Bio-Rad公司SsoFastTMEvaGreen Super Mix，引物由北京擎科生物合成，一般分析純生化試劑購自成都科龍化工。

主要儀器：Multipette stream電動分液器，德國Eppendorf公司；Echotherm恒溫震蕩器，美國Torrey Pines Scientific公司；設計裝源量200萬Ci自動化60Co-γ射線輻照裝置；5804r離心機，德國Eppendorf公司；Scandrop100核酸蛋白分析儀，德國耶拿公司；CFX-96 Real-time System，美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理 加熱和凍融是非輻照DNA損傷產生的主要原因，為區(qū)分輻照樣本和假陽性樣本的DNA損傷差異，采用了3種處理方式：（1）不同塊莖的馬鈴薯切片進行Co60γ射線輻照處理，輻照劑量梯度設定為 0.5、1、2、4、6、8、10 kGy［16］，每個劑量3個切片樣本，分別使用劑量片計量每個梯度的真實劑量，樣品編號設定為A1-A21。（2）不同塊莖的馬鈴薯切片進行95℃水浴處理，水浴時間分別為1 min、2 min和3 min，每種處理各3個重復，樣本編號H1-H9。（3）凍融處理樣本使用-40℃保存10 min后轉入20℃ 10 min，分別反復“速凍-解凍”3次、4次和6次，每種處理3個重復，樣本編號F1-F9。另取未處理馬鈴薯切片作為對照，編號為CK1-CK9。以上樣本均參照試劑盒說明書進行DNA提取，提取液65℃金屬浴揮發(fā)10 min，去除乙醇殘留，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選 從Nucleotide數據庫檢索馬鈴薯持家基因18s、12s、gapdh、actin序列，從馬鈴薯轉座子序列數據庫（http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml）檢索轉座子序列l(wèi)tr1、ltr2，使用NCBI網站引物設計工具Primer-Blast進行引物設計和篩選（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）， 共 獲得HK引物與TE引物13對（序列來源見表2）。

參照胡廣［17］操作步驟，取DNA模板CK1，測試待測引物擴增效率En。反應體系為10 μL，模板0.2 μL，預混液 5 μL，引物體系（1+1）μL，每種體系4個方法學重復。PCR程序為95.0℃ 2 min，95.0℃5 s，復性延伸60.0℃ 30 s，40次重復，95.0℃ 5 s，溶解曲線溫度范圍65-95℃，升溫速度0.5℃/5 s。

取DNA模板A19-A21和CK1-CK3，檢測待測引物的相對重復系數（Relative repeatability index，RRI）和相對輻照敏感系數（Relative sensibility index，RSI）。兩種系數的定義公式分別為RRIB=（1+En）△CT0（A，B），RSIB=（RRI-（1+En）△CTD（A，B））/D，其中△CT0（A，B）為未輻照模板中不同引物A，B間的初始循環(huán)數差值；△CTD（A，B）為輻照模板中不同引物A，B間的初始循環(huán)數差值。根據測試結果，按照定義公式計算各引物模板的RRI和RSI值，并按照以下標準進行TE引物篩選：

（1）將初始循環(huán)數最低引物設定為參照引物，參照引物的RRI和RSI值均為1；（2）計算其余引物的RRI和RSI值，排除其中RRI＞ 512的引物；（3）選擇RSI值相同或最接近的兩個引物對作為鑒別引物組合；（4）選擇RSI值差異最大兩個引物對作為劑量評估引物組合。

1.2.3 轉座子狀態(tài)分析 參照1.2.2步驟PCR體系，分別使用輻照鑒定引物組合對未輻照馬鈴薯DNA模板CK1-CK9進行定量PCR檢測。使用“ 單樣本t檢驗”分析結果中各組的差異性，分析選擇的轉座子序列狀態(tài)是否穩(wěn)定。

1.2.4 方法檢出限分析 參照1.2.2步驟反應體系，分別使用獲得的篩選引物體系檢測20個未輻照馬鈴薯DNA樣本，檢測初始循環(huán)數計算空白標準偏差（循環(huán)數），參照國標GBT5009.1-2003《食品衛(wèi)生檢驗方法 理化部分 總則》附錄A方法［18］計算優(yōu)化鑒定方法的檢出限。

1.2.5 DNA損傷特征分析 參照1.2.2步驟反應體系，對輻照樣本（A1-A21）和假陽性樣本（F1-F9、H1-H9）進行鑒定，比較不同處理方法導致的DNA損傷差異。計算測試樣本的 ΔΔCTD（A，B）值（A，B為引物組合），計算公式如下：

ΔΔCTD（A，B）=（CTD（B）-CT0（B））-（CTD（A）-CT0（A））

=（CTD（B）-CTD（A））-（CT0（B）-CT0（A））

其中，CTD（A）、CTD（B）分別為處理條件下引物 A、B 的初始循環(huán)數平均數，（CT0（B）- CT0（A））為未處理樣本初始循環(huán)數平均數。計算樣本A1-A21，F(xiàn)1-F9、H1-H9 的 ΔΔCTD（P1，P2）、ΔΔCTD（P3，P4）值。使用縱坐標 ΔΔCTD（P1，P2）與橫坐標 ΔΔCTD（P3，P4），進行散點圖分析，歸納不同處理方法的數據點分布特征。

1.2.6 數據統(tǒng)計分析 所有定量PCR結果均采用Bio-Rad CFX Manager 3.1進行數據讀取，使用Livak的2-ΔΔCT方法［19］進行相對定量模板分析，使用GraphPad Prism 6.0對測定結果進行數據分析。

2 結果

2.1 劑量測定

使用重鉻酸鉀（銀）化學劑量計測定實際劑量（誤差5%），結果如表1。除0.5 kGy與10 kGy劑量偏高外，基本符合設計劑量梯度。

表1 輻照組樣本實際劑量

2.2 引物篩選結果

參選引物的RRI、RSI值與擴增效率結果如表2。由表2可知，TE引物中RRI值最高為LTR2-5，因此將LTR2-5設定為基準引物，其RRI和RSI值均設定為1。根據1.2.2篩選條件，最終篩選獲得的引物體系為：（1）樣本鑒別引物組合：P1為LTR2-5，P2為 18S-8；P3為 LTR2-2，P4為 ACT-5；（2） 輻照鑒定引物組合：P5為LTR2-5，P6為18S-5。其中引物LTR2-5同時作為P1和P5。

2.3 轉座子狀態(tài)結果

如表3和表4所示，在未輻照馬鈴薯DNA樣本中，△ CT（18S-8，LTR2-5）值與△ CT（ACT-5，LTR2-2）值分別在各自組內無明顯差異，說明LTR2-5對應的逆轉座子序列分布穩(wěn)定，無明顯轉座活性。

表2 供篩選引物序列及參數

2.4 方法檢出限結果

根據步驟1.2.4，P1-P2空白標準偏差為0.20，方法檢出限為0.60；P1-P2空白標準偏差為0.13，方法檢出限為0.39；P5-P6空白標準偏差為0.06，方法檢出限為0.18。

表3 模板分布頻率的穩(wěn)定性分析

表4 單樣本t檢驗

2.5 DNA損傷特征結果

樣本A1-A21，F(xiàn)1-F9、H1-H9的數據點分布如圖1所示。從圖1可知，輻照組樣本（A1-A21）數據點的縱軸值 ΔΔCTD（P1，P2）均小于 0.60（P1-P2 方法檢出限），橫軸值 ΔΔCTD（P3，P4）均小于 0.39（P3-P4方法檢出限），不同輻照樣本中DNA損傷位點的相對分布頻率具有一致性，不受輻照劑量變化（1-12 kGy）的影響。相對于輻照組樣本，加熱組（H1-H9）和凍融組（F1-F9）樣本數據點中縱坐標或橫坐標值大于對應方法檢出限，呈現(xiàn)為相對于原點的離散分布。根據圖1中輻照和干擾樣本數據點的分布規(guī)律，這種一致性差異與處理方式本身或具有高度關聯(lián)性。

圖1 輻照處理引發(fā)的DNA損傷特征

2.6 劑量回歸分析結果

樣本 CK1-CK3 與 A1-A21 的 ΔΔCTD（P5，P6）與輻照劑量D的相關性結果如圖2所示。由圖2可知，輻照樣本的ΔΔCTD（P5，P6）值隨輻照劑量D增加而增加，呈正相關關系；而在ΔCTD（P5，P6）值上，呈現(xiàn)為隨劑量D增加而減小的負相關性。因此，分別使用ΔΔCTD（P5，P6）、ΔCTD（P5，P6）的 2 為底的指數函數值以及單引物LTR2-5和18S-5的ΔCTD值，與對應的輻照劑量進行線性回歸分析，獲得多種劑量標準曲線。

圖2 輻照劑量與循環(huán)數相關性

單獨TE引物LTR2-5或HK引物18S-5［20］的標準曲線中，R2分別為93.65%和92.45%（圖3-C）；而根據循環(huán)數差值/變化數的指數函數值獲得的線性關系均進入顯著區(qū)間（＞99%）（圖3-A、B），其中圖3-B中使用ΔCTD值的線性關系最優(yōu)（R2=99.24%），說明該回歸模式更符合劑量-效應的實際對應關系。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，RSI值相同或相近的引物（LTR2-5/18S-8、LTR2-2/ACT-5）之間，其初始循環(huán)數差值的變化值保持恒定，不受輻照劑量大小影響。而RSI值差異較大的引物（LTR2-5/18S-5），其初始循環(huán)數差值的變化值與劑量D成正相關關系。因此，DNA序列本身特性的RSI值，決定了不同引物間初始循環(huán)數差值的變化值是否會隨劑量變化而變化，該結論與李文建等［21］的報道一致。

圖3 不同引物體系的劑量回歸函數

根據已知結果，熒光定量PCR輻照鑒定優(yōu)化方法可歸納為以下5個步驟：（1）檢測未輻照樣本，獲得引物（P1-P5）的循環(huán)數結果，計算 CT0（P1，P2）、CT0（P3，P4）、CT0（P5，P6）的空白標準偏差和對應檢出限；（2）檢測梯度劑量輻照樣本，分別獲得ΔCTD（P5，P6）以2為底的指數函數值，通過回歸分析獲得該樣本“劑量-循環(huán)數差值指數函數”標準曲線；（3）檢測待優(yōu)化后鑒定體系構成為“五引物，雙模板（輻照與未輻照）”。其中TE引物的分布數高于HK引物，這與Mrigaya和Paz等［22-23］報道相符。引物LTR2-5對應模板為馬鈴薯逆轉錄轉座子酶蛋白質假設亞基編碼序列ty3-gypsy［24］，從屬于馬鈴薯基因組中7個超級重復基因家族之一的LTR/Gypsy［25］。LTR/Gypsy基因家族的片段在所有染色體均有分布［22］，呈現(xiàn)出比HK引物更高的檢測靈敏性。研究采用2組引物（4對）進行假陽性甄別，排除了可能的干擾現(xiàn)象（圖1）。理論上3組（6對）引物能達到更好的假陽性樣本辨識效果，但會大幅度降低測試通量。

研究的優(yōu)化點包括：（1）根據引物模板的RSI值來篩選引物，消除輻照敏感度差異對鑒定結果的影響；（2）使用高度重復的TE序列作為檢測標記物；（3）使用引物之間的初始循環(huán)數差值來對應輻照劑量變化，消除模板差異帶來的偏差；（4）優(yōu)化劑量線性關系中初始循環(huán)數的函數模型。

技術優(yōu)勢在于：（1）TE引物模板分布頻率高于HK引物，提高了檢測靈敏度；（2）使用相對比例，消除了DNA模板量差異對鑒定結果的影響；（3）使用優(yōu)化后的劑量標準曲線進行劑量分析。該方法與隨機引物擴增多態(tài)性DNA［26］（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）相比，功能上均可進行DNA的輻照損傷鑒定［27-28］，但RAPD檢測結果為凝膠電泳譜帶，需儀器觀察，且不能辨識輻照樣本；本方法結果為初始循環(huán)數差值，可直接量化分析，操作上更為簡便直觀。下一步工作中將通過構建多重探針體系［29］，提高檢測效率，擴大其適用范圍。

4 結論

測樣本，獲得5種引物（P1/P5、P2、P3、P4和P6）的循環(huán)數結果，計算3種引物組合的循環(huán)數差值的變化數 ΔΔCTD（P1，P2）、ΔΔCTD（P3，P4）和 ΔΔCTD（P5，P6）；（4）定性鑒定 ：若樣本的 ΔΔCTD（P1，P2）、ΔΔCTD（P3，P4）其中之一大于或等于對應檢出限，判定為假陽性樣本；若兩個值均小于對應檢出限，則為正常樣本；正常樣本中 ΔΔCTD（P5，P6）大于對應檢出限的，判定為輻照樣本 ；（5）劑量分析 ：基于樣本的 ΔCTD（P5，P6）值，通過步驟2的“劑量-循環(huán)數差值指數函數”的標準曲線進行劑量評估。

應用轉座子重復序列引物，對輻照鑒定定量PCR技術進行了方法優(yōu)化，篩選得到包含轉座子引物在內的“五引物，雙模板”的鑒定體系。該優(yōu)化方法可甄別加熱、凍融處理的假陽性樣本，消除模板差異影響，增強了熒光定量PCR輻照鑒定技術的“劑量-效應關系”。