口蹄疫病毒通用型和A型二重實時熒光RT-PCR檢測方法的建立

謝彩華，班付國，閆若潛，王東方，張 煜，劉梅芬，趙雪麗，馬震原，王華俊，王淑娟

（1. 河南省動物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州 450008；2. 開封市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南開封 475000）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-andmouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的豬、牛、羊等家養(yǎng)及野生偶蹄動物共患的一種急性、惡性、高度接觸性傳染病，70多種動物對其易感[1-3]。該病傳播途徑多、速度快，曾在世界范圍內(nèi)多次暴發(fā)流行，造成巨大政治影響和經(jīng)濟損失[4-5]，為此世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告動物傳染病。FMD也是危害我國養(yǎng)豬業(yè)最為嚴重的動物疫病之一，為此我國將其列為一類動物疫病，被納入國家強制免疫計劃病種。FMDV為小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬，最大顆粒直徑為23 nm，最小為7～8 nm。目前已知FMDV在全世界有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和AsiaⅠ型7種血清型，且各血清型之間的交叉保護力很差[6]。在我國和鄰國流行的主要有O、A、AsiaⅠ三種血清型[7]。由于FMDV血清型較多，因此利用簡單、快速、準確的檢測方法，盡早作出型的鑒別診斷，對控制FMD至關(guān)重要。目前，世界口蹄疫參考實驗室檢測FMDV及定型的常規(guī)方法仍是ELISA、病毒分離、RT-PCR等[8-9]。實時熒光定量PCR（Fluorescent quantitative PCR， FQ-PCR）是一種新型診斷工具，具有敏感、快速、準確的特點，并能在快速擴增核酸同時，實現(xiàn)模板的定量測定[10-11]。目前發(fā)展起來的多聯(lián)實時熒光PCR技術(shù)可以在同一個PCR反應(yīng)中，通過Tm值分析來區(qū)分不同的核酸片段，這為同時檢測多種病原提供了技術(shù)基礎(chǔ)。本研究根據(jù)O、A、AsiaⅠ三種血清型 的FMDV保守基因序列，設(shè)計了能夠檢測到FMDV多種血清型的特異性通用型和A型檢測引物，以及不同熒光素標記的MGB探針，建立了FMDV通用型、A型二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法，為FMD的鑒別診斷提供了快速、敏感、特異的臨床檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與樣品 O、A和AsiaⅠ型FMDV標準株：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所試劑盒中的陽性對照；滅活的豬水泡病病毒（SVDV ）、豬水泡性口炎病毒（VSV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細小病毒（PPV）和豬肺炎支原體等：河南省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室提供；臨床樣品：河南省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室提供；SVDV、VSV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV、PPV陽性樣品：河南省動物疫病預(yù)防控制中心保存。

1.1.2 儀器設(shè)備與主要試劑 KingFisher全自動核酸提取儀：購自美國Thermo Fisher公司；DNA/RNA磁珠提取試劑盒：購自Abmion公司；ABI 7500熒光定量PCR儀：購自美國ABI公司；Ex Taq DNA聚 合 酶、Rnase Inhibitor、DL 2 000 bp DNA Marker、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒：購自寶生物工程（大連）有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、pGEM-T Easy載體：購自Promega公司；口蹄疫熒光定量RT-PCR檢測試劑盒：購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 經(jīng)大量比對GenBank中FMDV 3種血清型的保守基因序列和FMDV-A型VP1基因序列，選取FMDV O、A、AsiaⅠ三種血清型的3C基因和FMDV-A型VP1基因高度保守且具有型特異性的序列為模板，設(shè)計通用型（FMDV-T）和A型（FMDV-A）特異性引物對和TaqMan MGB探針。序列為：P1：5'-cggcctctcatccaacaga-3'；P2：5'-attttccttcaggcgcttga-3'；P3：5'-aaccccaccgcctacca-3'；P4：5'-ggtgtaagggagcgcaagtc-3'；Probe-P5：5'-FAM-tcatttgtgaaacgcg-MGB-3'；Probe-P6：5'-VIC-aagcagccgtttacg-MGB-3'。引物及探針均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2 模板制備 利用King fisher全自動核酸提取儀，參照磁珠法核酸提取試劑盒說明書提取O/A/AsiaⅠ FMDV、SVDV、VSV、PRRSV、PEDV 總RNA和PCV2、PRV、PPV總DNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA和總DNA用于PCR擴增或于?20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 FMDV-T/FMDV-A標準品制備 將FMDV-T/FMDV-A陽性擴增產(chǎn)物分別克隆入pGEM-T Easy載體中，篩選陽性重組質(zhì)粒，送寶生物工程（大連）有限公司采用T7和SP6引物進行測序。將測序正確的FMDV-T/FMDV-A重組陽性質(zhì)粒，應(yīng)用分光光度計測定其OD260和OD280并計算OD260/OD280值，共重復(fù)5次；參考Kim等[12]介紹的方法計算濃度，計算得出的pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A質(zhì)粒DNA濃度分別為9.12×1010和9.11×1010拷貝 /μL，然后定量并稀釋至 1.0×100～1.0×1010拷貝 /μL，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 二重FQ-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 將pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重組質(zhì)粒分別稀釋至終濃度1.0×105拷貝/μL，并以此作為檢測模板。P1/P2、P3/P4引物和Probe-P5、Probe-P6探針分別稀釋為終濃度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和 1.0 μmol/L。應(yīng)用熒光 PCR儀，采用矩陣法篩選不同濃度的FMDV-T/FMDV-A引物和探針組合，對PCR 反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、PCR 的各循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化，以獲得最低Ct 值和較高的熒光強度。

1.2.5 二重FQ-PCR特異性試驗 取O/A/AsiaⅠFMDV，以及豬水皰病等其他7種疫病病毒進行核酸提取，同時設(shè)pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重組質(zhì)?；旌衔餅殛栃詫φ眨毎囵B(yǎng)液為陰性對照，按已優(yōu)化的FQ-PCR反應(yīng)條件進行FQ-PCR擴增，以驗證該方法的特異性。

1.2.6 二重FQ-PCR敏感性試驗 將pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重組質(zhì)粒分別作10倍系列稀釋，將兩種質(zhì)粒按1:1比例混合，每種質(zhì)粒終濃度調(diào)整為 1.0×104～1.0×100拷貝 /μL，共5個稀釋度，按已優(yōu)化的FQ-PCR反應(yīng)條件進行FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR敏感性試驗。

1.2.7 二重FQ-PCR穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗 分別將4個濃度的10倍系列稀釋的pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重組等量質(zhì)?；旌衔铮糠N質(zhì)粒終濃度 1.0×103～1.0×100拷貝 /μL），按照已優(yōu)化的FQ-PCR反應(yīng)條件進行擴增，每個系列設(shè)定3個重復(fù)，以驗證該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.2.8 二重FQ-PCR臨床試驗 依據(jù)建立的FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR和本實驗室建立的FMDV-T/FMDV-A RT-PCR檢測方法以及中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所熒光定量RT-PCR試劑盒說明書，配制檢測試劑，以FMDV-T/FMDV-A陽性質(zhì)?；旌衔餅殛栃詫φ眨毎囵B(yǎng)液為陰性對照，對123份臨床疑似FMDV感染樣品（樣品編號1～123）進行應(yīng)用檢測，對這3種方法的檢測結(jié)果進行比較分析，并與FMDV測序結(jié)果比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 二重FQ-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

結(jié)果表明，通用型和 A 型各引物和探針采用以下濃度擴增效果最好：反轉(zhuǎn)錄引物37 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h；P1、P3、P5、P6 濃度均為 200 nmol/L，P2、P4濃度均為400 nmol/L。優(yōu)化后的反應(yīng)程序為：94 ℃ 6 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，重復(fù) 40 個循環(huán)。陰性對照的檢測結(jié)果應(yīng)無特定擴增曲線，且Ct＞30.0或無，陽性對照Ct≤27.0，且出現(xiàn)特定的擴增曲線，判定檢測結(jié)果成立。在檢測結(jié)果成立的前提下，若樣品檢測結(jié)果Ct≤30.0，且出現(xiàn)特定的擴增曲線，判定為陽性；Ct＞30.0或無，且無特定的擴增曲線，則判定為陰性；30.0≥Ct＞27.0且有特定擴增曲線的樣品判定為可疑，需重復(fù)驗證。FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR的擴增曲線見圖1。

圖1 FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR的擴增曲線

2.2 二重FQ-PCR特異性試驗

用所建立的二重?zé)晒?RT-PCR，對FMDV O、A、AsiaⅠ型進行檢測，發(fā)現(xiàn)通用型FAM通道陽性，A型VIC通道陽性，對其他7株常見動物 RNA/DNA病毒檢測均呈陰性反應(yīng)。試驗數(shù)據(jù)表明，所設(shè)計的引物探針只對目的病毒特異，與其他檢測對象無交叉反應(yīng)（圖2）。

圖2 FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR方法的特異性試驗

2.3 二重FQ-PCR敏感性試驗

按已優(yōu)化的FQ-PCR反應(yīng)條件進行檢測，發(fā)現(xiàn)pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A終濃度為 1.0×104～1.0×100拷貝 /μL，共 5 個稀釋度的質(zhì)粒；FMDV-T和FMDV-A最低檢出限均為1.0×101拷貝 /μL（表 1） 。

2.4 二重FQ-PCR穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗

表1 二重FQ-PCR敏感性試驗結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，濃度為1.0×105、1.0×104、1.0×103拷貝/μL 3個濃度的FMDV-T/FMDV-A重組質(zhì)粒等量混合物3次試驗結(jié)果均為陽性，濃度為1.0×102拷貝/μL的FMDV-T/ FMDV-A重組質(zhì)粒等量混合物3次試驗結(jié)果均為陰性，說明建立的FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR方法具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性（表2）。

表2 二重FQ-PCR方法的重復(fù)性試驗結(jié)果

2.5 二重FQ-PCR臨床試驗

結(jié)果顯示：采用本研究建立的FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR檢測，10份為FMDV-T陽性，6份為FMDV-T/FMDV-A雙陽性，其余為陰性；采用RT-PCR檢測，9份為FMDV-T陽性，6份為FMDV-T/FMDV-A雙陽性；蘭州獸醫(yī)研究所的熒光定量RT-PCR試劑盒檢測，10份為FMDV-T陽性，6份為FMDV-T/FMDV-A雙陽性。結(jié)果表明，本研究建立的FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR方法比RT-PCR方法靈敏性高。該FQ-PCR方法檢測結(jié)果與和FMDV基因測序結(jié)果及蘭州獸醫(yī)研究所的熒光定量試劑盒檢測結(jié)果符合率為100%，表明建立的FMDV-T/FMDV-A二重FQ-PCR方法具有很好的臨床應(yīng)用效果。

3 討論

本研究主要在同一反應(yīng)管內(nèi)進行FMDV 通用型和A型的二重擴增檢測反應(yīng)，同時收集代表FMDV通用型和A型的熒光信號，對擴增產(chǎn)物進行實時在線檢測，從而建立了能夠同時檢測FMDV通用型及A型二重鑒別實時熒光RT-PCR方法。實驗室試驗和田間試驗均證實，該方法是一種快速、簡便、高效的檢測平臺。目前，我國主要流行O型和A型FMD，而AsiaⅠ型自2009年之后未見臨床病例報道[4]，并且國家已退出AsiaⅠ型FMD的強制免疫，因此主要針對FMDV的O型和A型進行病原鑒別診斷。本研究建立的二重FMDV通用型和A型檢測方法為國內(nèi)流行FMDV血清型的鑒別診斷提供了方便、快速、特異、靈敏的檢測方法。

多重實時熒光 RT-PCR 可同時進行FMDV不同亞型的鑒別檢測[12]，因而大大縮短了檢測周期。在臨床混合感染前期，病毒主要以潛伏感染形式存在，病毒量很低。而本研究建立的二重FQ-PCR檢測FMDV-T和FMDV-A的最低檢出限為1.0×101拷貝/μL，因此也能準確檢測區(qū)分出來。

口蹄疫是豬、牛、羊等家養(yǎng)及野生偶蹄動物共患的傳染病，與多種病毒病的臨床癥狀類似，但本研究因受病原毒株限制，僅與SVDV、VSV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV、PPV等7種病原進行了特異性試驗，未與豬塞內(nèi)卡病、水泡性口炎、豬水泡疹、羊口瘡、羊痘等與口蹄疫癥狀類似的疫病病原同時進行檢測驗證，因此仍需進一步研究完善。

4 結(jié)論

本研究成功建立了FMDV通用型和A型二重鑒別實時熒光 RT-PCR 檢測方法。檢測表明，該方法重復(fù)性好、敏感性高、特異性強，最低檢測模板濃度為10 拷貝/μL，可用于FMDV的快速檢測及分型鑒定。本研究為FMDV的早期快速檢測、型鑒別診斷提供了特異、敏感、快速的新方法，具有一定的臨床應(yīng)用價值。