豬偽狂犬病毒gB抗原側(cè)向?qū)游隹焖贆z測(cè)試紙條的研制

王華俊，班付國(guó)，趙雪麗，謝彩華，閆若潛，王淑娟，馬震原，王東方，王 翠

（河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州 450008）

豬偽狂犬?。≒orcine pseudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）引起的豬急性傳染病，在豬群中常呈暴發(fā)性流行，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。近年來(lái)我國(guó)各地均有PR發(fā)生，尤其是2010年以來(lái)，由PRV基因變異強(qiáng)毒株為主要病原的仔豬流行性腹瀉病嚴(yán)重危害了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，造成新生仔豬大量發(fā)病死亡，種豬嚴(yán)重繁殖障礙，育肥豬也有發(fā)病死亡[1-5]。該病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）法定報(bào)告動(dòng)物疫病，是我國(guó)的二類動(dòng)物疫病，也是《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》要求優(yōu)先凈化的疫病之一。

PRV 屬于皰疹病毒科（Herpesviridae），其基因組為線性雙鏈DNA，大小約150 kb，基因組編碼16種囊膜蛋白。其中g(shù)B糖蛋白較為保守，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，是免疫保護(hù)相關(guān)蛋白[6-7]。因此，檢測(cè)PRV gB抗原是判定豬體內(nèi)是否存在PRV的重要手段。

目前PRV的檢測(cè)方法有數(shù)字微滴PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、直接免疫熒光檢測(cè)方法、液相芯片技術(shù)等[8-11]。但這些檢測(cè)方法因需要特殊儀器設(shè)備，操作復(fù)雜，耗時(shí)耗力或不能快速檢測(cè)病原等，無(wú)法應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)，

又稱免疫色譜檢測(cè)，已被廣泛應(yīng)用于激素、過(guò)敏原、藥物、病毒、細(xì)菌等領(lǐng)域的檢測(cè)分析[12-14]，具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果易于判斷、成本低廉、敏感性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是以上方法中最便捷的一種[15-16]。本研究采用側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)和單克隆抗體技術(shù)，建立一種簡(jiǎn)便、快速、敏感，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層推廣的PRV檢測(cè)方法，將對(duì)該病凈化和根除提供新的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

抗PRV gB單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株10G4和6E9：河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心制備并保存；弗氏不完全佐劑、氯金酸、檸檬酸三鈉：Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清：荷蘭Sra公司產(chǎn)品；DMEM高糖培養(yǎng)基：博士德公司產(chǎn)品；Millipore HF135：Millipore公司產(chǎn)品；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：寶生物公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA）：索萊寶公司產(chǎn)品；試紙條耗材：為上海金標(biāo)生物公司產(chǎn)品。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

1.2 方法

1.2.1 抗PRV gB單克隆抗體10G4和6E9的制備 采用20%血清DMEM高糖培養(yǎng)基，分別復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞株10G4和6E9，并調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期；將10G4和6E9細(xì)胞接種于經(jīng)弗氏不完全佐劑處理過(guò)1周的Balb/C小鼠；7～10 d后，待小鼠腹部明顯隆起，取小鼠腹水；4℃ 12 000 r/min離心10 min，去除上層油脂，取上清即為腹水；采用辛酸-硫酸銨兩步沉淀法純化腹水，并進(jìn)一步采用Protein G親和層析，用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定濃度后分裝凍存于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 膠體金制備 用量筒取200 mL 超純水，倒入已硅化好的圓底燒瓶中，混勻；將圓底燒瓶放在磁力攪拌電熱套的加熱套內(nèi)，放入磁力攪拌子，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為180 r/min，加熱至沸騰；繼續(xù)加熱5 min，先加入0.6 mL 10%（w/v）的氯金酸，然后加入0.96 mL 10%的（w/v）檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱10 min，直至溶液變?yōu)榱疗咸鸭t色，停止加熱；自然冷卻至室溫，用超純水將金溶液體積定容至200 mL。加入不同劑量的檸檬酸三鈉溶液（1.02、1.08 mL）制備不同粒徑膠體金。采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描鑒定，按照回歸方程y=0.427x+514.56（y為最大吸收波長(zhǎng)，x為膠體金粒徑，單位為nm）計(jì)算粒徑大小，并采用透射電鏡鑒定。

1.2.3 最適標(biāo)記pH和最佳抗體標(biāo)記量?jī)?yōu)化 將所得的膠體金用0.1 mol/L 碳酸鉀調(diào)節(jié)pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；取各 pH 的膠體金溶液500 μL于一系列膠體金潤(rùn)洗后的EP管中，在以上各pH條件下，用膠體金標(biāo)記抗PRV gB單克隆抗體 10G4，蛋白標(biāo)記量分別為4、6、8、10、12、14、16 μg，混勻后靜置 30 min；加入10% BSA至終濃度為1%，混勻后靜置10 min，9 000 r/min 離心10 min 后，重懸噴涂在膠體金結(jié)合墊上，組裝成檢測(cè)試紙條并檢測(cè)滅活的1:200倍稀釋PRV培養(yǎng)液，當(dāng)試紙條性能最佳時(shí)，即為最適標(biāo)記pH和最佳抗體標(biāo)記量。

1.2.4 膠體金標(biāo)記抗PRV gB單克隆抗體10G4 于硅化處理后的燒杯中，加入5 mL膠體金，用0.1 mol/L 碳酸鉀調(diào)節(jié)至pH8.0，靜置5 min；在磁力攪拌作用下緩慢滴加抗體，繼續(xù)攪拌30 min，加入10% BSA至終濃度為1%；混勻后靜置10 min，9 000 r/min 離心10 min，棄上清，加入金標(biāo)抗體重懸液2.5 mL重懸。將制備的膠體金標(biāo)記抗體，用三維噴金劃膜儀噴涂在金標(biāo)結(jié)合墊上，37 ℃真空干燥1 h，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測(cè)試紙條條件優(yōu)化

1.3.1 膠體金標(biāo)記抗體包被濃度確定 將制備的膠體金標(biāo)記抗體，分別用重懸液做1、1.5、2、2.5和3倍稀釋，噴涂于金標(biāo)結(jié)合墊上，噴量為10 μL/cm，于37 ℃真空干燥箱中烘干1 h，然后裁切成寬5 mm 條狀，并組裝檢測(cè)試紙條，進(jìn)行陰性和陽(yáng)性樣本檢測(cè)，依據(jù)試紙條背景色、檢測(cè)線（T）和抗質(zhì)控線（C）顯色確定最佳稀釋濃度。

1.3.2 檢測(cè)線（T）和抗質(zhì)控線（C）抗體包被濃度確定 將濃度為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/mL抗PRV gB單克隆抗體 6E9，分別與濃度為0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL的兔抗小鼠IgG抗體組合，用三維噴金劃膜儀，分別噴涂在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線（T）和質(zhì)控線（C）位置，噴量為1 μL/cm，間距為5 mm，組裝成檢測(cè)試紙條，經(jīng)陽(yáng)性和陰性樣品檢測(cè)，觀察C、T線顯色情況，選擇最佳濃度的C、T線抗體包被NC 膜。

1.3.3 試紙條裝配 將樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維膜、吸水墊和硬質(zhì)聚氯乙烯背襯，按順序粘貼組裝，用金標(biāo)斬切儀切成5 mm 寬的長(zhǎng)條，即為PRV gB抗原側(cè)向?qū)游隹焖贆z測(cè)試紙條。試紙條的裝配見(jiàn)圖1。

圖1 試紙條模型

1.4 試紙條臨床應(yīng)用

1.4.1 待檢樣本處理 用拭子取豬鼻、眼腺、口腔分泌物，糞便或病變組織（研磨處理）樣品，插入樣品稀釋液（體積比為0.05%的吐溫-20 0.01 mol/L、pH7.4 的PBS）中洗滌，混勻，重復(fù)2～3次；

1.4.2 結(jié)果判定 取60～80 μL處理后樣品直接滴加到樣品墊上，10～15 min觀察結(jié)果。C、T線均顯色，表示陽(yáng)性；只有C線顯色，表示陰性；若只有T線顯色或沒(méi)有條帶，結(jié)果無(wú)效，需重新檢測(cè)。

1.4.3 試紙條敏感性試驗(yàn) 用樣本稀釋液，對(duì)TCID50為1×108.6/0.1 mL的PRV陽(yáng)性樣品進(jìn)行1:80、1:160、1:320、1:640、1:1 280倍比稀釋；取3個(gè)批次試紙條檢測(cè)，每個(gè)批次3個(gè)，觀察結(jié)果并確定試紙條的檢測(cè)下限。

1.4.4 特異性試驗(yàn) 用3個(gè)批次試紙條，分別檢測(cè)來(lái)源于臨床疑似病例并經(jīng)對(duì)應(yīng)疫病國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法鑒定為豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬偽狂犬病毒（PRV）的陽(yáng)性樣品，每個(gè)批次3個(gè)，觀察結(jié)果。

1.4.5 試紙條穩(wěn)定性試驗(yàn) 將試紙條干燥密封，分別保存于4 ℃、室溫和37 ℃環(huán)境下，每間隔一定時(shí)間，取出檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和陰性樣品，觀察其敏感性和特異性變化。

1.4.6 試紙條與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較 采集來(lái)自不同豬場(chǎng)的PR疑擬病例病變組織（腦、肺、肝、脾、淋巴結(jié)、流產(chǎn)胎兒等）及豬眼腺、鼻分泌物60份和國(guó)家級(jí)PR凈化場(chǎng)豬眼腺、鼻分泌物45份、病料15份。剪取適量病料與600 μL樣品稀釋液混合，充分研磨，然后將豬眼腺、鼻分泌物加入200 μL樣品稀釋液，混勻；用試紙條和RT-PCR檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)處理后的樣品，評(píng)估兩種檢測(cè)方法符合率。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)兩種檢測(cè)方法的比較統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 22 Kappa一致性檢驗(yàn)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 10G4和6E9單克隆抗體濃度、效價(jià)和純度

親和層析純化后，10G4和6E9單克隆抗體濃度分別為 3.87、4.55 mg/mL，間接ELISA法測(cè)得其效價(jià)均為 1:204 800，SDS-PAGE 電泳分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng) Protein G層析柱純化后的抗體純度均大于90%，可用于膠體金標(biāo)記。

2.2 膠體金顆粒鑒定

用紫外分光光度計(jì)，對(duì)制備的3種膠體金進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰分別為528、522、518 nm，粒徑大小分別約為31.5、17.5、10.0 nm，波峰較窄，顆粒分布均勻，大小一致（圖2）；根據(jù)大分子蛋白標(biāo)記條件，選擇1號(hào)為標(biāo)記膠體金。對(duì)1號(hào)進(jìn)行透射電鏡鑒定，發(fā)現(xiàn)粒徑大小為31.7 nm，顆粒圓潤(rùn)，分散均一（圖3），與紫外分光光度計(jì)鑒定結(jié)果基本一致。

圖2 膠體金可見(jiàn)光光譜

圖3 膠體金電鏡圖片（50 000×）

2.3 最適標(biāo)記pH和最佳抗體標(biāo)記量

膠體金標(biāo)記后組裝成檢測(cè)試紙條并檢測(cè)病毒培養(yǎng)液，當(dāng)pH為8.0，抗體標(biāo)記量為12 μg時(shí)，試紙條敏感性最高，即為最適標(biāo)記pH和最佳抗體標(biāo)記量。

2.4 最適稀釋倍數(shù)、最適檢測(cè)線和質(zhì)控線抗體包被濃度

當(dāng)對(duì)膠體金標(biāo)記抗體做2倍稀釋，T線抗體濃度為1.25 mg/mL， C線二抗為0.75 mg/mL時(shí)，試紙條C、T線顯色最佳，敏感性高、特異性強(qiáng)、背景色淺，為最佳條件。

2.5 試紙條質(zhì)量評(píng)估

2.5.1 試紙條敏感性 經(jīng)測(cè)試，該檢測(cè)試紙條最低能檢測(cè)出1:640倍稀釋的，TCID50為1×108.6/0.1 mL的滅活PRV抗原（圖4）。

圖4 試紙條敏感性檢測(cè)

2.5.2 試紙條特異性 試紙條與CSFV、PRRSV、PCV2、PPV、PEDV均無(wú)均交叉反應(yīng)，陽(yáng)性對(duì)照T線顯色，特異性良好（圖5）。

圖5 試紙條特異性檢測(cè)

2.5.3 試紙條穩(wěn)定性 試紙條穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，試紙條在4 ℃條件下至少保存10個(gè)月，室溫干燥密閉條件下至少保存10個(gè)月，37 ℃條件下可保存12 d，有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2.5.4 試紙條臨床檢測(cè)結(jié)果評(píng)估 試紙條與RTPCR方法的符合率評(píng)估結(jié)果顯示，試紙條檢測(cè)陽(yáng)性42份、陰性78份，RT-PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性48份、陰性72份，二者陽(yáng)性和陰性符合數(shù)為104份，符合率為86.67%[(37+67)/120×100%=86.67%]。建立的試紙條檢測(cè)評(píng)價(jià)四格表如表1。經(jīng)SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件分析，Kappa一致性檢驗(yàn)，K=0.716，提示兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致性較高，表明免疫膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)結(jié)果正確率較高。

表1 引物序列

3 討論

本研究利用實(shí)驗(yàn)室保存的抗PRV gB單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體，結(jié)合側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)，成功建立了一種快速、簡(jiǎn)便、敏感、易判定，適合基層大面積普查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)應(yīng)用的PRV gB 免疫膠體金檢測(cè)試紙條。經(jīng)檢測(cè)試該試紙條最低能檢測(cè)出1:640倍稀釋的，TCID50為1×108.6/0.1 mL的滅活PRV抗原，與CSFV、PRRSV、PCV2、PPV、PEDV均無(wú)均交叉反應(yīng)，室溫干燥密閉條件下至少保存10個(gè)月，具有良好的敏感性、特異性和穩(wěn)定性。經(jīng)Kappa一致性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)K=0.716，提示兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致性較高，表明免疫膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率較高，在臨床上有良好的應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)發(fā)展前景。本試紙條的研制為PR凈化和根除提供了新的檢測(cè)手段。

選擇粒徑20～40 nm膠體金顆粒作為標(biāo)記示蹤劑，可使檢測(cè)試紙條獲得最佳性能[18]。本研究使用檸檬酸三鈉作為原法劑，采用電爐加熱制備膠體金并利用紫外分光光度計(jì)和透射電鏡，對(duì)制備的膠體金進(jìn)行質(zhì)量鑒定，發(fā)現(xiàn)鑒定結(jié)果基本一致，粒徑大小為31.5 nm，符合穩(wěn)定、均一、圓潤(rùn)的膠體金制備標(biāo)準(zhǔn)[19]。

其他方法通常采用OD值曲線法來(lái)確定膠體金標(biāo)記抗體最適標(biāo)記pH和最小蛋白標(biāo)記量，在此基礎(chǔ)上多加20%蛋白。而本研究采用棋盤法，以試紙條敏感性和特異性為標(biāo)準(zhǔn)，確定最適標(biāo)記pH和蛋白標(biāo)記量，使結(jié)果更直觀，能真實(shí)反映試紙條性能，同時(shí)提高了試紙條敏感性。

目前，PRV gE抗體檢測(cè)廣泛應(yīng)用于PRV野毒感染分析，尚缺乏直接檢測(cè)豬PR病原的血清學(xué)方法。豬感染PRV后7～14 d才產(chǎn)生血清抗體，因而通過(guò)抗體檢測(cè)野毒感染相對(duì)滯后。檢測(cè)PRV gB抗原是判定豬體內(nèi)是否存在PRV的重要手段。本研究將該試紙條與分子病原學(xué)PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)總符合率為86.67%。由于檢測(cè)原理不同，二者符合率低于90%，表明試紙條敏感性有待進(jìn)一步提高。今后將采用新的標(biāo)記示蹤劑、生物信號(hào)放大系統(tǒng)等方式優(yōu)化其敏感性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合單克隆抗體技術(shù)和側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)制備了PRV gB抗原檢測(cè)試紙條。經(jīng)測(cè)試，該試紙條敏感性高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，是一種快速、簡(jiǎn)便、易判定，適合基層大面積推廣應(yīng)用的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法，商業(yè)應(yīng)用前景良好，從而為PR凈化根除提供了新的檢測(cè)手段。