天津市錦鯉皰疹病毒PCR檢測與序列分析

霍奕安，劉榮榮，胡秀彩，呂愛軍，孫敬鋒，陳成勛

（1. 天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2. 天津農(nóng)學院創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實驗室，天津 300384）

錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）又稱為鯉科皰疹病毒3型（CyHV-3），是引起高度傳染性錦鯉皰疹病毒?。↘HVD）的病原[1-3]。1998年KHV首次在以色列和美國引發(fā)疫情，2002年在我國廣東省被發(fā)現(xiàn)，隨后陸續(xù)到傳播到我國其他地區(qū)。至今已有30多個國家或地區(qū)陸續(xù)報道發(fā)生該病[4]。KHVD潛伏期長，突發(fā)性高，給鯉魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重危害。目前來自不同國家的4個KHV DNA全基因序列已被測序[5]。病毒檢測和減毒疫苗免疫是KHVD最主要的控制措施[6]。

錦鯉是我國觀賞魚的主要養(yǎng)殖品種之一，在國內(nèi)淡水養(yǎng)殖魚類中占很大比例，一旦暴發(fā)KHVD，往往帶來巨大經(jīng)濟損失，所以開展KHV相關研究十分重要。2017年6月，天津市濱海新區(qū)、北辰區(qū)等一些養(yǎng)殖場的錦鯉陸續(xù)大量發(fā)病死亡，3 d內(nèi)死亡率高達85%。病魚表現(xiàn)爛鰓、鰓絲發(fā)白、鱗片脫落等癥狀，以及內(nèi)臟器官出血、糜爛等剖檢病變，疑似感染KHV。本研究根據(jù)KHV基因序列分別設計合成TK、SphI-5、ORF25、ORF56和ORF81基因特異性引物，采用PCR技術檢測KHV相關功能基因，為KHVD診斷及流行病學分析提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗魚、試劑及儀器

試驗魚：天津市濱海新區(qū)、北辰區(qū)等一些養(yǎng)殖場送檢的發(fā)病錦鯉，平均體長為（6±0.5）cm；試劑及儀器：DL 2 000 bp DNA Marker（天津生工生物公司），DNA提取試劑盒、PCR Master Mix（天根生化科技有限公司），Buffer藍DNA染料（北京鼎國昌盛生物技術公司），PCR擴增儀（德國Analytikjena公司）。

1.2 引物設計與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的KHV TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因序列（AP008984.1），利用Primer Premiers 5.0軟件設計特異性引物（表1）。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 基因PCR擴增

表1 錦鯉皰疹病毒 TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因引物設計

分別取患病錦鯉的鰓、腎臟、脾臟、肝臟、胰臟等組織勻漿，使用DNA提取試劑盒提取DNA，將所得DNA樣品通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR方法采用25 μL反應體系： Mix 10 μL，DNA模板 1 μL，上下游引物各 1 μL（10 μmol/L），加雙蒸水至25 μL。反應條件如下：95 ℃預變性5 min，94 ℃ 40 s，59.3 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)。其中，陰性對照加雙蒸水，引物加TK基因。

1.4 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

選取錦鯉皰疹病毒3型J2株（CyHV-3/KHV-J2）、錦鯉皰疹病毒2型（CyHV-2）的ORF56蛋白為參考序列，應用GeneDoc軟件進行序列比對分析。從GenBank下載KHV的ORF56基因序列，通過MEGA5.0進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建，并分析進化親緣關系。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病錦鯉臨床癥狀及初診

發(fā)病錦鯉大量死亡，死亡率高達85%以上。病魚呈現(xiàn)眼部凹陷、爛鰓、鰓絲發(fā)白、鱗片脫落、體表黏液增多等癥狀，以及鰓壞死、內(nèi)臟器官出血糜爛等剖檢病變（圖1）。

圖1 錦鯉皰疹病毒病的臨床特征

2.2 基因檢測與序列比對

以錦鯉鰓和肝胰臟等組織器官的DNA為模板，分別對KHV TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)均為陽性（圖2）；DNA測序獲得 TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因片段分別為 409、300、317、939、156 bp。經(jīng)BlastN檢索，發(fā)現(xiàn)與印度尼西亞毒株CyHV-3-J2的TK基因序列同源性為99.2%（AOO32620.1）、SphI-5為97.6%（AOO32619.1）、ORF25為97.8%（AP008984.1）、ORF56為 100%（KX544843.1）、ORF81為98.0%（AVL27853.1）。進一步選取錦鯉皰疹病毒3型J2株（CyHV-3/KHV-J2）、錦鯉皰疹病毒2型（CyHV-2）等進行序列比對，發(fā)現(xiàn)ORF56蛋白與KHV蛋白的151～253 aa為高保守區(qū)域（圖3）。

2.3 ORF56基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析

選取11個KHV ORF56相關基因進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析，發(fā)現(xiàn)KHV天津流行株與CyHV-3型病毒親緣關系最近，并且與印度尼西亞CyHV-3-J2毒株自然聚為一支，最終確定天津市患病錦鯉感染的病毒為CyHV-3型（圖4）。

圖2 KHV基因PCR檢測電泳圖

圖3 ORF56相關蛋白的氨基酸序列比對分析

圖4 基于KHV病毒ORF56基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

3 討論

KHVD作為一種全國流行性魚類病毒病，其流行株主要為CyHV-3型病毒，已引起我國高度重視。近年來，雖然世界多地在KHVD臨床癥狀、檢測診斷、疫苗制備等方面進行了大量研究，但仍不足以有效控制該病，其依舊在威脅著我國錦鯉養(yǎng)殖業(yè)。

PCR檢測技術具有簡便、快速，對標本純度要求低以及靈敏度高等特點，在水產(chǎn)病毒病診斷領域被廣泛應用[9-11]。自從Gilad等[12]應用PCR技術建立了CyHV-3檢測方法后，PCR及其延伸技術成為水生動物疾病檢測的常用方法。本試驗針對KHV的TK、SphI-5基因，以及ORF25、ORF56、ORF81等未知功能基因，建立特異性PCR方法進行檢測，最終確診為錦鯉皰疹病毒3型（CyHV-3）。分析顯示，其與已報道的印度尼西亞病毒株CyHV-3-J2親緣關系最近[13-15]。此外，建立的CyHV-3型病毒ORF25、ORF56、ORF81等未知功能基因PCR檢測方法，不僅有助于了解KHV的基因功能及致病機制，而且為KHV的分子診斷及流行病學調(diào)查奠定了基礎。