6種人獸共患病病原核酸液相芯片檢測體系的建立

王 艷，沈家紅，蔣 蔚，張磊萍，張 強(qiáng)，林穎崢，熊 煒，李樹清

（1. 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135；2. 上海市浦東新區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201299；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

布魯氏菌?。˙rucellosis，以下簡稱布病）是由布魯氏菌（Brucella）感染引起的一種全球分布的人獸共患病，主要影響感染宿主泌尿生殖系統(tǒng)，不僅會給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還會嚴(yán)重影響人類健康[1-2]。沙門氏菌（Salmonella）是一類人獸共患病原菌[3]，廣泛分布于自然界中，其中鼠傷寒沙門氏菌是最常見的一種血清型，鼠類可以傳播本病。弓形蟲病（Toxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）感染引起的一種高度流行的人獸共患病，可給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。狂犬病是由狂犬病病毒屬（Lyssavirus，LV）引起的一種高度嗜神經(jīng)、人和動物都易感的烈性傳染病[6]。漢賽巴爾通體（Bartonella henselae）是一種革蘭氏陰性棒狀短小桿菌，近年來在許多家養(yǎng)和野生哺乳動物中（包括家養(yǎng)犬、貓，野生貓科、犬科動物，嚙齒動物和反芻動物）都已檢測到[7]，人也可感染，因而備受關(guān)注。彎曲菌屬（Campyolbacter）是20世紀(jì)70年代命名的一群革蘭氏陰性微需氧的彎曲或螺形菌。研究表明實驗動物腸道內(nèi)也存在彎曲菌感染[8]。

本研究以布魯氏菌、沙門氏菌、弓形蟲、狂犬病病毒、巴氏通體、彎曲桿菌這6種重要人獸共患病病原為對象，基于多重PCR技術(shù)的液相芯片檢測體系，建立了能同時檢測這6種病原的檢測方法，并對其靈敏度、特異性等指標(biāo)進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鏈霉素-親和素-藻紅蛋白（SAPE）：購自美國Invitrogen公司；表面羧基化的熒光編碼微球：購自美國Bio-Rad公司；Luminex 200液相芯片檢測儀：美國Luminex公司產(chǎn)品；沙門氏菌（Sal）、布魯氏菌（Bru）、弓形蟲（Tox）質(zhì)粒：由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所友情饋贈；狂犬病病毒（Rab）、巴爾通體（Bar）、彎曲桿菌（Camp）質(zhì)粒：由上海出入境檢驗檢疫局動物檢疫實驗室保存。所有質(zhì)粒均克隆在PUC57載體上；將制備的質(zhì)粒采用雙純水配制成500拷貝/μL的濃度，?20 ℃保存?zhèn)溆?。所有樣品均為進(jìn)出境實驗動物拭子或全血樣品。

1.2 方法

1.2.1 探針及引物的設(shè)計和合成 根據(jù)GenBank登錄的沙門氏菌、布魯氏菌和弓形蟲基因序列，應(yīng)用Primer 5.0序列分析軟件進(jìn)行序列分析、引物、探針設(shè)計，使探針的Tm值盡量保持在56～58 ℃，分別在探針的上下游設(shè)計特異性的擴(kuò)增引物（表1）。引物、探針?biāo)蜕虾Ｉ锕こ逃邢薰煞莨竞铣?。將引物用水溶解?00 mmol/L的貯存母液備用。

1.2.2 單對引物及多重引物擴(kuò)增性能檢測 將單對引物及多重引物，分別對多目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，以鑒定引物的特異性。單重PCR反應(yīng)配制為：10×buffer（Mg2+）2.5 μL、dNTP（2.5 mol/L）1.0 μL、引物 1.0 μL、模板 2.0 μL、HotstarTaq 0.5 U、ddH2O 18.5 μL，總 PCR 體系為 25 μL。多重 PCR引物加入量為：BruF1/R2 2.5 pmol，SalF1/R1 2.0 pmol，ToxF3/R5 1.0 pmol，RabF2/R1 2.0 pmol，BarF4/R2 2.5 pmol，CampF1/R3 1.0 pmol。PCR 擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 20 s，35 個循環(huán)，72 ℃再延伸 1 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上行電泳檢測。

表1 探針和引物序列

1.2.3 微球探針交聯(lián) 取相應(yīng)的熒光編碼微球100 μL（表 2），5 000 r/min 離心 10 min 后棄上清，用雙蒸水洗滌2次；用100 μL 0.1 mol/L pH6.0的MES重新懸浮后，加入0.2 nmol/μL的探針3 μL，充分混勻后，加入15% EDC，37 ℃避光孵育30 min；離心棄上清，用0.1% SDS洗滌2次，用50 μL TE緩沖液（pH8.0）重新懸浮后，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 探針名稱及對應(yīng)編碼微球

1.2.4 雜交捕獲檢測 取PCR產(chǎn)物5 μL，加入微球溶液25 μL（每種微球按照2 000個/25 μL），充分混合均勻后，先94 ℃變性3 min，再50 ℃孵育30 min；接著加入 SA-PE（濃度 0.2 μg/μL）70 μL，繼續(xù)孵育20 min；將Luminex 200加熱板加熱到50 ℃，并調(diào)整至度數(shù)狀態(tài)。孵育結(jié)束后直接上機(jī)讀取信號。根據(jù)Luminex公司推薦的判定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)每種熒光編碼微球個數(shù)不小于20個，且背景空白熒光強(qiáng)度不高于300時，表明試驗成立，可以進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.5 探針特異性檢測 按照每個反應(yīng)25 μL體系，將6種微球混合，對每對單一引物進(jìn)行雜交，以檢測探針的特異性。

1.2.6 液相芯片檢測體系建立 將特異性好的探針與多重PCR產(chǎn)物混勻雜交，設(shè)置儀器為同時檢測6種熒光編碼微球。取20份陰性樣品，采用建立的液相芯片法進(jìn)行檢測，計算每種特異性檢測微球平均熒光強(qiáng)度（Median fluorescent intensity，MFI）的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，以均數(shù)+3倍標(biāo)準(zhǔn)差所得的值作為對應(yīng)檢測指標(biāo)的cut-off值，確定閾值，高于cut-off值就視為陽性。

1.2.7 液相芯片檢測體系特異性 提取其他方法確定為陽性的沙門氏菌、布魯氏菌、弓形蟲、狂犬病病毒、巴氏通體、彎曲桿菌、小鼠肝炎病毒（MHV）、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）、仙臺病毒（SeV）、小鼠肺炎病毒（MPV）的DNA，并以此作為PCR擴(kuò)增模板，用建立的液相芯片法進(jìn)行雜交檢測。

1.2.8 液相芯片檢測體系靈敏度 將Bru、Sal、Tox、Bru、Rab、Camp質(zhì)粒DNA分別依次進(jìn)行5、10、50倍稀釋，并分別作為PCR擴(kuò)增模板，用建立的液相芯片檢測體系進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 單對引物及多重引物擴(kuò)增性能檢測

電泳結(jié)果（圖1）顯示，單對引物和多重引物均能特異性擴(kuò)增目的基因，表明引物具有良好的特異性。

圖1 引物擴(kuò)增性能的檢測結(jié)果

2.2 探針特異性檢測

6種微球?qū)我灰飻U(kuò)增產(chǎn)物的雜交檢測結(jié)果如表3。數(shù)據(jù)顯示，混合的6種探針針對單對引物擴(kuò)增片段能有效識別捕獲，且每種探針對其余兩種目的產(chǎn)物沒有明顯的非特異性雜交信號，其MFI均低于100。顯示設(shè)計的探針序列針對6種擴(kuò)增產(chǎn)物具有較好的特異性。

2.3 液相芯片檢測體系建立

對用其他方法確定為陰性的20份樣品，將經(jīng)DNA抽提、PCR擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物用于液相芯片檢測，用液相芯片法測得MFI均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，計算出的閾值為91.55+3×9.83=112.04（表4）。

2.4 液相芯片檢測體系特異性

特異性檢測結(jié)果顯示（表5），建立的液相芯片檢測方法對 Bru、Sal、Tox、Rab、Bar、Camp有特異性雜交反應(yīng)，均為陽性，而與其他重要病原病毒質(zhì)粒未產(chǎn)生雜交反應(yīng)，表明該方法具有良好的特異性。

表3 探針特異性檢測結(jié)果

表4 液相芯片檢測體系閾值的確定

2.5 液相芯片檢測體系靈敏度

采用以上確定的檢測體系，對系列濃度模板進(jìn)行檢測。數(shù)據(jù)顯示，所建立的液相芯片檢測體系的檢測靈敏度大致為50拷貝/反應(yīng)（表6）。

3 討論與結(jié)論

目前，上述6種人獸共患病的檢測方法主要有血清學(xué)方法、細(xì)菌培養(yǎng)法、細(xì)胞培養(yǎng)法。這些傳統(tǒng)的檢測方法不但耗時費(fèi)力，而且可能會延誤疫情控制，造成更大的經(jīng)濟(jì)損失和人類健康危害。液相芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的，被譽(yù)為后基因組時代的芯片技術(shù)。它有機(jī)整合了有色微球、激光技術(shù)、高速數(shù)字信號處理和計算機(jī)技術(shù)，具有通量大、靈敏度高、用量少等優(yōu)點。

表5 液相芯片檢測體系特異性檢測

表6 液相芯片檢測體系靈敏度檢測 單位：拷貝/反應(yīng)

本研究利用液相芯片技術(shù)，建立了能特異性檢測 Bru、Sal、Tox、Rab、Bar、Camp等 6種病原的液相芯片檢測方法。該檢測方法能夠?qū)δ繕?biāo)基因進(jìn)行快速檢測，檢測靈敏度可達(dá)50拷貝/反應(yīng)，特異性好。因此，本研究建立的高通量液相芯片檢測方法，對布魯氏菌、沙門氏菌、弓形蟲，狂犬病病毒、巴氏通體、彎曲桿菌6種病原的快速篩查提供了技術(shù)支撐。