氧化石墨烯-DNA納米熒光探針用于檢測牛奶中的三聚氰胺

常晨陽，常 凱，劉麗蓉，韋 偉，朱秀煥，劉 偉，魏艷霞

（1. 聊城檢驗檢疫局，山東聊城 252200；2. 董家口港檢驗檢疫局，山東青島 266400；3. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

三聚氰胺（Melamine，C3H6N6）是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，具有生物毒性，食用后能誘發(fā)腎衰竭并導(dǎo)致死亡，是一種禁止用于食品及動物飼料的化學(xué)物質(zhì)[1]。三聚氰胺中氮含量高達(dá)66%，多出蛋白質(zhì)氨基酸中氮含量的3～4倍，在乳制品中摻雜添加可虛假提高蛋白質(zhì)含量。我國一直對乳制品實行嚴(yán)格的三聚氰胺監(jiān)控，已制定了多個乳制品中三聚氰胺檢測國家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 22388—2008、GB/T 22400—2008、SN/T 3627—2013和SN/T 4479—2016等）。目前，最常用的三聚氰胺檢測方法有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[2]。高效液相色譜串聯(lián)紫外或DAD檢測器可直接檢測三聚氰胺，而氣質(zhì)聯(lián)用法需要對三聚氰胺進(jìn)行衍生化處理（BSTFA+TMCS，99+1），增加處理過程；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀具有較高的檢測靈敏度，在部分實驗室主要作為確定陽性定量使用，但因儀器昂貴，限制了其在某些檢測平臺的廣泛使用。為此，尋找高靈敏度、高選擇性，適合快速現(xiàn)場篩選的新檢測方法一直是三聚氰胺檢測研究的熱點(diǎn)。

納米材料具有特殊的微觀尺寸，可展現(xiàn)出介觀、宏觀物質(zhì)所不具備的獨(dú)特物理化學(xué)性能，自20世紀(jì)80年代末，便倍受關(guān)注并廣泛應(yīng)用，逐步發(fā)展為具有龐大分支的學(xué)科領(lǐng)域[3]。納米熒光探針以納米材料為載體，具有合成簡單、經(jīng)濟(jì)、檢測快速，以及無需復(fù)雜前處理過程、靈敏度高等特點(diǎn)，表現(xiàn)出傳統(tǒng)檢測技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢，已被應(yīng)用于多種物質(zhì)的檢測傳感器中[4]。近年來，不斷有將納米探針用于三聚氰胺檢測的報道[5-8]，但多數(shù)研究限于檢測簡單水相，尚未實現(xiàn)在食品安全檢測領(lǐng)域的技術(shù)突破。氧化石墨烯（GO）作為一種新型納米材料，具有獨(dú)特的物理化學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，近年來在生物傳感方面的應(yīng)用越來越廣泛[9]。本研究設(shè)計的低熒光復(fù)合物GO-DNA納米熒光探針，利用氧化石墨烯納米材料獨(dú)特的猝滅效應(yīng)，依據(jù)修飾近紅外熒光染料的DNA分子和三聚氰胺分子同氧化石墨烯間相互作用的不同，在三聚氰胺存在的情況下，可檢測到被猝滅熒光信號的恢復(fù)。其檢測原理為，氧化石墨烯和標(biāo)記熒光基團(tuán)的單鏈寡核苷酸（DNA-Cy5）單獨(dú)存在時，氧化石墨烯會吸附單鏈DNA，使得熒光染料靠近氧化石墨烯產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET及電子轉(zhuǎn)移PET，從而導(dǎo)致熒光猝滅[10]；而溶液中存在三聚氰胺時，由于三聚氰胺特殊的分子平面結(jié)構(gòu)，與石墨烯間的分子作用力遠(yuǎn)強(qiáng)于石墨烯與DNA間的相互作用力[11]，導(dǎo)致三聚氰胺分子將DNA鏈從石墨烯表面競爭下來，使得修飾的熒光基團(tuán)Cy5因遠(yuǎn)離石墨烯表面而使被猝滅的熒光得到恢復(fù)，在檢測波長處能檢測到熒光信號。熒光信號的大小與加入三聚氰胺的量在一定檢測范圍內(nèi)存在正相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 氧化石墨烯（GO）：購自南京先豐納米材料科技有限公司；所用核苷酸Cy5-DNA序列（5'-Cy5-GCTTTCACTA-3'）：由上海生物工程有限公司合成并經(jīng)HPLC純化；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：購自德國Dr公司；三氯乙酸、Tris緩沖、NaCl、KCl、MgCl2等試劑：購自醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；化學(xué)試劑：均為分析純級別，未經(jīng)其他處理直接使用；試驗所用水：Mill-Q二次超純水（18.2 MΩ·cm-1）。

1.1.2 儀器 透射電子顯微鏡（JEM-100CXΠ，JEOL，日本）；200 kV 高分辨透射電子顯微鏡（日本，JEM-2100）；pH-3C型酸度計（上海雷磁儀器廠）；FLS-980 型熒光分光光度計（英國，Edinburgh Instruments Ltd）；高速離心機(jī)（日本日立 CF16RXⅡ）；電子天平（瑞士梅特勒ME303）

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制 三聚氰胺使用液的配制：取12.6 mg粉末溶于1 mL 50%的甲醇/水（v/v）溶液中，得到濃度為100 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；Cy5-DNA鏈：根據(jù)HPLC純化后的濃度，用Milli-Q水配制成10 μmol/L的母液備用。

1.2.2 GO-DNA納米探針制備 將確定濃度的GO與100 nmol/L的熒光標(biāo)記的Cy5-DNA鏈，25 ℃水浴環(huán)境下，在緩沖溶液（20 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2）中混合后靜置 10 min，將反應(yīng)后的溶液離心（8 000 r/min，20 min）純化處理，重新分散在二次水中，以GO濃度記為相應(yīng)的探針濃度，將其放置于4 ℃冰箱儲存。

1.2.3 GO 用量優(yōu)化 將GO水溶液由初始濃度1 mg/mL改變?yōu)槭褂脻舛?、2、3、5、8、10、15、20 μg/mL，然后分別與 100 nmol/L 的 Cy5-DNA混合10 min，測量熒光強(qiáng)度的猝滅程度。檢測Cy5熒光信號的激發(fā)波長為648 nm，發(fā)射波長為665 nm，狹縫設(shè)置為2 nm。

1.2.4 恢復(fù)動力學(xué) 以優(yōu)化濃度后的GO（8 μg/mL）和100 nmol/L 的Cy5-DNA合成探針后，加入濃度為500 nmol/L的三聚氰胺，37 ℃下孵育，然后測定不同時間的熒光恢復(fù)強(qiáng)度。

1.2.5 納米探針熒光恢復(fù) 利用以上優(yōu)化好的數(shù)據(jù)，取1 mL體系，在8 μg/mL的GO-Cy5-DNA復(fù)合物納米探針中，分別加入不同濃度的三聚氰胺（0～3 000 nmol/L），37 ℃下孵育30 min后，測定加入不同濃度三聚氰胺對應(yīng)的熒光恢復(fù)強(qiáng)度。

1.2.6 納米探針特異性試驗 納米探針（8 μg/mL）與10 mmol/L葡萄糖、果糖、麥芽糖、賴氨酸、酪氨酸、苯胺分別在37 ℃下孵育30 min后測其熒光強(qiáng)度。

1.2.7 牛奶樣品應(yīng)用分析 所用牛奶直接從超市購買，并添加不同濃度的三聚氰胺。預(yù)處理步驟為：取1 mL牛奶與4 mL高純水溶于10 mL離心管中，然后加入0.5 mL 1%三氯乙酸（m/m），超聲處理10 min后，12 000 r/min離心5 min，上清液用二次水稀釋到10 mL 后用1 mol/L的Na2CO3溶液中和至pH7，然后加入探針檢測。

2 結(jié)果

2.1 納米復(fù)合物電鏡和AFM表征

圖1-a 為透射電子顯微鏡（TEM）下氧化石墨烯的形貌，可見氧化石墨烯呈現(xiàn)單層的片狀結(jié)構(gòu)，尺寸為50～500 nm 。在DNA鏈吸附到石墨烯表層后（圖2-b），氧化石墨烯載體的形貌大小及分散性基本沒有變化；通過量子力學(xué)顯微鏡（AFM）表征氧化石墨烯的厚度，發(fā)現(xiàn)厚度為1.5 nm左右，而吸附DNA鏈后的GO-DNA復(fù)合物的厚度增加到4.0 nm左右，可以驗證DNA鏈被成功吸附在氧化石墨烯表面，成功形成了納米復(fù)合物。

圖1 透射電子顯微鏡（TEM）圖

2.2 GO-DNA探針檢測體系性能評價

2.2.1 探針合成、GO 用量優(yōu)化及探針的恢復(fù)動力學(xué) 不同濃度的GO與100 nmol/L的Cy5-DNA反應(yīng)10 min 后，由測得的熒光數(shù)據(jù)可見，Cy5熒光強(qiáng)度隨著GO濃度的增加而降低，當(dāng)GO濃度為8 μg/mL時，熒光染料熒光基本被全部猝滅，因此選擇 GO濃度為8 μg/mL合成探針。加入500 nmol/L的三聚氰胺后，檢測37 ℃孵育下，體系在不同時間的熒光強(qiáng)度變化。根據(jù)數(shù)據(jù)可得，加入三聚氰胺后10 min內(nèi)，體系就能快速響應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)的熒光信號。當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到30 min時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，之后基本不發(fā)生變化，因此選擇30 min作為測定探針熒光恢復(fù)的時間。

2.2.2 納米探針熒光恢復(fù) 在納米探針中加入不同濃度的三聚氰胺后，測定納米探針對目標(biāo)分子三聚氰胺的熒光恢復(fù)情況，做出熒光回復(fù)曲線（圖2）?？梢?，隨著三聚氰胺濃度的增加，熒光強(qiáng)度先呈現(xiàn)線性增長，隨后增長緩慢，當(dāng)三聚氰胺濃度達(dá)到約3 mmol/L時，基本達(dá)到最大熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)分析顯示，當(dāng)加入的三聚氰胺濃度較低（90～1 500 nmol/L）時，熒光恢復(fù)曲線基本呈現(xiàn)線性，三聚氰胺濃度與熒光強(qiáng)度的線性擬合方程為y=280.6+9.35x，線性相關(guān)系數(shù)為 0.996。

圖2 GO-DNA探針熒光恢復(fù)曲線

2.2.3 納米探針特異性 為評價本研究設(shè)計的納米探針檢測的特異性，研究了牛奶制品中常見的葡萄糖、麥芽糖、果糖及與三聚氰胺有結(jié)構(gòu)相似的賴氨酸、酪氨酸、苯胺等分子對目標(biāo)物的干擾。試驗證明，納米探針能與低濃度的三聚氰胺特異性結(jié)合而產(chǎn)生較大的熒光恢復(fù)，而對高出幾十倍濃度（10 mmol/L）的葡萄糖、果糖、賴氨酸、酪氨酸、苯胺幾乎沒有任何響應(yīng)，說明納米探針對三聚氰胺具有很好的選擇特異性。

2.2.4 納米探針檢測牛奶中的三聚氰胺 牛奶基質(zhì)相對于水相體系，主要是去除蛋白質(zhì)類雜質(zhì)對三聚氰胺檢測的干擾，因此選用1%的三氯乙酸對牛奶進(jìn)行了簡單預(yù)處理，以沉淀牛奶中的蛋白質(zhì)。通過在不同種類市售液態(tài)奶中添加500 nmol/L濃度的三聚氰胺進(jìn)行檢測加標(biāo)回收，可見加標(biāo)樣品的回收率為93%～102%，且重復(fù)性良好（表1）。該探針對奶粉中三聚氰胺的檢測低限可達(dá)30 nmol/L，遠(yuǎn)低于我國規(guī)定的奶制品中三聚氰胺含量不得高于1 mg/kg的要求，可應(yīng)用于實際牛奶樣品中三聚氰胺的檢測，具有應(yīng)用價值。

表1 樣品及回收率測定結(jié)果

3 討論

本研究設(shè)計的納米復(fù)合熒光探針是基于GO對熒光染料的猝滅效應(yīng)而建立的。研究證明，GO可以吸附單鏈DNA形成GO-DNA復(fù)合物，并通過π-π堆積及FRET效應(yīng)，有效猝滅DNA 鏈端標(biāo)記熒光染料Cy5的熒光?；谌矍璋贩肿恿h(huán)的平面結(jié)構(gòu)推測，它可以和GO表面發(fā)生較強(qiáng)的相互作用。三聚氰胺的加入后，導(dǎo)致其與DNA在GO表面發(fā)生競爭，使DNA鏈從GO表面脫落進(jìn)入溶液，因而可以檢測到熒光恢復(fù)（圖3）。具體地，選擇一段長度為10 bp、Cy5標(biāo)記的單鏈DNA序列，通過與GO吸附形成 GODNA復(fù)合探針，此時Cy5-DNA的熒光被有效猝滅，而加入三聚氰胺后，熒光將得到恢復(fù)，因而熒光信號強(qiáng)度與三聚氰胺量在一定檢測范圍內(nèi)將成正比。

圖3 GO-DNA納米熒光探針檢測三聚氰胺原理

本研究利用GO納米材料獨(dú)特的猝滅效應(yīng)，根據(jù)修飾近紅外熒光染料的DNA分子和三聚氰胺分子同氧化石墨烯間作用力的不同，設(shè)計出一種合成簡單、選擇性好的檢測三聚氰胺的納米熒光探針。該探針具有如下優(yōu)點(diǎn)：一是在三聚氰胺存在的情況下，可檢測到被猝滅熒光信號的恢復(fù)，屬于"turnon"型，靈敏度高；二是使用到的熒光染料的激發(fā)和發(fā)射熒光光譜在近紅外波段，具有低的樣品基質(zhì)背景干擾；三是可以檢測牛奶中不同濃度的三聚氰胺，具有良好的應(yīng)用性。