羌活地上部位化學(xué)成分及其對農(nóng)業(yè)病原真菌的作用

劉景坤，宿安詳，謝 敏，燕志強(qiáng)， 李秀壯，楊曉燕，金 輝，秦 波

(1.中國科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院 西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

羌活(NotopterygiumincisumTing ex H. T. Chang或?qū)捜~羌活NotopterygiumfranchetiiH. de Boiss.)為傘形科羌活屬多年生草本植物，常用中藥材，以干燥根及根莖入藥，其性溫，味辛，具有解表散寒、祛風(fēng)、除濕、止痛的功效[1-2]。羌活喜高寒，野生資源分布于云南、四川、青海、甘肅一帶，范圍較窄[3]。近年來，隨著中醫(yī)中藥理念的發(fā)展，消耗量不斷增加，野生資源不能滿足需求，藥農(nóng)開始進(jìn)行大量人工栽培，其中以川西、甘肅、青海等地為主產(chǎn)，產(chǎn)量可達(dá)4 t/hm2，這不僅能滿足市場需求，增加藥農(nóng)收益，而且是保護(hù)野生資源和西部生態(tài)多樣性的重要手段[4-6]。

羌活植株叢生，株高可達(dá)1 m，地上部位生物量較大，3 a總產(chǎn)量約為地下部分的3～5倍，但由于不能入藥，生產(chǎn)中往往被丟棄在農(nóng)田中。據(jù)文獻(xiàn)報道，植株殘體分解所產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)往往是其化感物質(zhì)的重要來源之一，能引起作物連作障礙[7-9]。羌活地上部位丟棄不僅可造成再植障礙，而且也會影響周圍植物的生長，降低植被覆蓋率，對本已脆弱的西北生態(tài)多樣性造成一定的影響[10-11]。羌活全株散香，富含揮發(fā)油、有機(jī)酸和香豆素類活性成分[12-17]，目前有關(guān)其根部化學(xué)成分提取、分離、鑒定的文獻(xiàn)較多，而對地上部位化學(xué)成分的關(guān)注較少，劉衛(wèi)根等[18]僅對比了地上部位與入藥部位中香豆素成分和含量。對羌活地上部位化學(xué)成分系統(tǒng)分析和開發(fā)利用的研究鮮見報道。

本研究對羌活地上部位化學(xué)成分進(jìn)行分析，研究其揮發(fā)性成分中所含的活性化合物的種類，以及非揮發(fā)性成分中重要藥效組分的含量；并將其提取物應(yīng)用于3種重要農(nóng)業(yè)病原菌，考察其對重要病原菌的生理活性。為羌活地上部位的處理提供合理的參考，提高植物資源的利用率，這不僅能為植物天然抑菌成分的發(fā)掘和開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和有效的研究材料，而且對于實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)“兩減”和推動綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展[19]具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

寬葉羌活(NotopterygiumfranchetiiH.de Boiss.)2016年11月采集自甘肅省宕昌縣哈達(dá)鋪鎮(zhèn)，2 a生人工栽培，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為傘形科羌活屬植物寬葉羌活；番茄早疫病病原菌(Alternariasolani)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinere，灰霉病病原菌)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum，枯萎病病原菌)均由中科院西北特色植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。試驗(yàn)所用分析純?nèi)軇?乙醇、甲醇等)購自西隴試劑公司，色譜純試劑(丙酮、甲醇、乙腈等)購自Fisher公司，分析標(biāo)準(zhǔn)品購自百靈威公司，生物試劑(瓊脂等)購自阿拉丁公司，其他試劑購自國藥上海試劑廠。

單四級桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent，7890A-5975C)，毛線管氣相色譜柱為HP-5MS(Agilent)；液相色譜儀(美國Waters，2695)，配C18色譜柱(Waters，symmetry 5 μm×4.6 mm×250 mm)及DAD紫外檢測器；萬分之一天平(瑞士梅特勒，AL204)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國海道夫，4000)，超凈工作臺(蘇州凈化，SW-CJ-2FD)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 采集的羌活去除根、根莖、枯葉、雜草，陰干晾曬，去除泥土等雜物，晾干后打碎，稱取100 g ，用φ=90%乙醇浸泡18 h后超聲浸提6 h(重復(fù)3次)，將提取液用雙層濾紙過濾后再抽濾(0.45 μm)。低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，稱量計算出膏率。稱量浸膏0.05 g兩份，一份用丙酮溶解過膜(0.22 μm)后氣質(zhì)聯(lián)用分析；另一份用甲醇溶解過膜(0.22 μm)后液相色譜分析。

1.2.2 儀器分析 氣質(zhì)聯(lián)用分析：進(jìn)樣口溫度230 ℃，柱溫70 ℃起，5 ℃/min升溫至280 ℃，保持20 min，輔助加熱器280 ℃，四級桿溫度150 ℃，離子源溫度250 ℃，He做載氣，柱流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，掃描范圍30～500 aMu，溶劑延遲1.0 min。

液相色譜分析：選取羌活體內(nèi)代表性香豆素化合物羌活醇、補(bǔ)骨酯素、東莨菪內(nèi)酯、秦皮苷為對象，分析其在莖葉組織中的分布情況。用甲醇配制質(zhì)量濃度為10、2.5、1.25、0.625、0.125 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品采用梯度洗脫，流動相為甲醇(A)和水(B)，梯度線性變化如下：0～15 min，20%～40% A；15～20 min， 40%～65% A；20～40 min，65% A；40～60 min, 90% A；流速0.8 mL/min, 檢測波長310 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫28℃±3 ℃。

1.2.3 提取物對植物病原真菌的作用 采用帶毒平板法考察提取物對常見作物病原真菌的作用[20]。無菌條件下稱取適量的浸膏，加入二甲亞砜(DMSO)和吐溫80進(jìn)行助溶，待PDA培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右時將培養(yǎng)基倒入浸膏溶液中混勻，使DMSO和吐溫80的體積分?jǐn)?shù)為1.5%，浸膏的質(zhì)量濃度為20、10、5、2.5、1.25 mg/mL。將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，冷凝后，用無菌打孔器選取菌落生長狀況一致的菌絲平板打取菌餅(直徑4 mm)，并將菌餅接種至上述帶浸膏的平板上。對照組不加浸膏，僅加相同濃度的DMSO和吐溫80。每個濃度和菌株在一個平板中接種3個菌餅為平行試驗(yàn)。所有接種平板放至于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約3 d后觀察長勢，并用十字交叉法對每個菌落直徑測量2次求直徑平均，3個菌落再次取平均，計算抑制率，抑制率=(對照組菌落平均半徑-試驗(yàn)組菌落平均半徑)/對照組菌落平均半徑×100%。使用SPSS 19.0求出回歸方程，半數(shù)有效濃度(EC50)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 羌活地上部分提取物分析

2.1.1 氣質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果 在上述氣相色譜和質(zhì)譜條件下，得到的總離子流如圖1所示，峰的數(shù)量較多表明其揮發(fā)性成分復(fù)雜，使用NIST 11.0標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行對比，共得到200多個組分，其中匹配度在80% 以上的物質(zhì)有為53個，匹配度90以上的物質(zhì)有40個(表1)。從表1中可以看出，揮發(fā)性成分主要是小分子的酸(如棕櫚油酸、十七烷酸、肉豆蔻酸等)、酮(植酮等)、烯(畢澄茄烯、石竹烯、新異長葉烯等)、醇類(紅沒藥醇、二氫山芹醇等)。采用面積歸一法進(jìn)行相對定量發(fā)現(xiàn)，占比較大的是長鏈脂肪酸、植物甾醇、部分烯類以及部分酰胺類物質(zhì)。

圖1 羌活提取物的總離子流圖(GC-MS)Fig.1 Total ion chromatography spectrμm(GC-MS) of extract of N.incisum

名稱Name分子式Molecular formulaCAS號CAS No.匹配度Matching degree相對含量/%Relative content2-(4-甲基苯基)丙-2-醇 2-(4-Methylphenyl)propan-2-olC10H14O001197-01-9930.2543-亞甲基-6-(1-甲基乙基)環(huán)己烯 3-Methylene-6-(1-methylethyl)cy-clohexeneC10H16000555-10-2900.0362-羥基桉樹腦 2-Hydroxy eucalyptusC10H18O2018679-48-6930.178檸檬烯二醇 Limonene diolC10H18O2001946-00-5930.384石竹烯 CaryophylleneC15H24000087-44-5990.145蓽澄茄烯 CadineneC15H24000483-76-1930.204月桂酸 Lauric acidC12H24O2000143-07-7900.174氧化石竹烯 OxeteneC15H24O001139-30-6910.068新異長葉烯 NeoisophyleneC15H241000156-12-4950.201α-紅沒藥醇 alpha-BisabololC15H26O000515-69-5950.338(Z)-環(huán)氧α-紅沒藥烯(Z)-Epoxy α-bisaboleneC15H24O1000131-71-1900.026肉豆蔻酸 Myristic acidC14H28O2000544-63-8990.108植酮 KetoneC18H36O000502-69-2900.101環(huán)十六烷 CyclohexadecaneC16H32000295-65-8920.0552-異丙基-5-甲基-9-亞甲基-二環(huán)(4.4.0)-1-癸烯2-Isopropyl-5-methyl-9-methylene-bicyclo(4.4.0)-1-deceneC15H24150320-52-8920.129棕櫚油酸 Palmitoleic acidC16H30O2000373-49-9990.1032,4-二(2-戊烯-4-基)-6-甲基-苯酚2,4-Bis(2-penten-4-yl)-6-methyl-phenolC17H24O017258-43-4900.221棕櫚酸乙酯 Ethyl palmitateC18H36O2000628-97-7970.145十七烷酸 Heptadecanoic acidC17H34O2000506-12-7950.0751-十八烯 1-OctadeceneC18H36000112-88-9950.668葉綠醇 ChlorophyllC20H40O000150-86-7980.557亞油酸 Linoleic acidC18H32O2000060-33-3990.2325,6,7,8-四氫-3-甲氧基-8,8-二甲基-1,4-菲二酮5,6,7,8-Tetrahydro-3-methoxy-8,8-dimethyl-1,4-phenanthridineC17H14O3030684-14-1920.2034-(4-乙基環(huán)己烷基)-1-戊烷基-環(huán)己烯4-(4-Ethylcyclohexane)-1-pentyl-cyclohexeneC19H36301643-32-3980.221(Z, Z)-10,12,-乙酸十六碳烯醇Z,Z-10,12-Hexadecadien-1-ol acetateC18H32O21000130-89-5910.118(Z)-9,17-十八醛 (Z)-9,17-OctadecadienalC18H32O056554-35-9950.287十二烯基丁二酸酐 Dodecenyl succinic anhydrideC16H26O3019780-11-1930.171(E)-6-(3-羥基-3-甲基-1-丁烯基)-7-甲氧基-2-H-1-苯并呋喃-2-酮(E)-6-(3-hydroxy-3-methyl-1-butenyl)-7-methoxy-2-H-1-benzofu-ran-2-oneC15H16O4018529-47-0910.3275-羥基補(bǔ)骨酯素 5-hydroxypsoralenC11H6O4000486-60-2950.217(+)-二氫山芹醇 (+)-DihydrosorbinolC14H14O4003804-70-4980.496花生酸 Arachidic acidC20H40O2000506-30-9950.3184α-甲基-7-丙基-2-十氫萘-2-酮4α-Methyl-7-propyl-2-dehydronaphthalen-2-oneC14H24O054594-42-2960.417十五碳烷 PentadecaneC15H32022089-89-0911.258二十碳烷 EicosaneC20H42000112-95-8910.881芥酸酰胺 ErucamideC22H43NO000112-84-5981.362反式角鯊烯 Trans-squaleneC30H50000111-02-4952.495維生素E Vitamin EC29H50O2000059-02-9982.006豆甾醇 StigmasterolC29H48O000083-48-7992.583γ-谷甾醇 γ- SitosterolC29H50O000083-47-6993.667

羌活全株具有獨(dú)特的芳香氣味物質(zhì)，這與其體內(nèi)的揮發(fā)性成分具有重要的關(guān)系[12, 15-16]，特別是芳香性的烯、酮、酰胺類化合物是其氣味的主要來源之一；另外，在揮發(fā)性化合物中，有很多物質(zhì)如異龍腦、石竹烯、檸檬烯、二氫山芹醇等具有殺菌的生物活性[12,15-16]；此外，還有谷甾醇、豆甾醇、麥角固醇等甾體類、維生素E以及少量酰胺類化物可能在其生長過程中產(chǎn)生重要作用。

2.1.2 液相色譜分析結(jié)果 經(jīng)液相色譜分析，羌活干燥的莖葉中秦皮苷未檢出，東莨菪內(nèi)酯、補(bǔ)骨酯素、羌活醇3種香豆素類化合物均檢出，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為16.0±1.2 μg/g，55.0±4.0 μg/g， 1.24±0.30 mg/g。可以看出，東莨菪內(nèi)酯和補(bǔ)骨酯素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在莖葉中較小，羌活醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大。羌活中含有多種香豆素類化合物，是其特征性成分，其中羌活醇和異歐前胡素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，對羌活芳香性氣味貢獻(xiàn)也較大。盡管有文獻(xiàn)報道[17]羌活藥用部位根和根莖中羌活醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)可超過10 mg/g ，是地上部位的近10倍，但羌活為多年生植物，生長較慢且根莖產(chǎn)量有限，但地上部位為1 a生，且產(chǎn)量較大，因此地上部位中所含的羌活醇資源也值得研究和開發(fā)利用。

1.秦皮苷 Fraxin;2.東莨菪內(nèi)酯 Scopoletin；3.補(bǔ)骨酯素 Psoralen;4.羌活醇 Notopterol

2.2 羌活地上部分提取物抑菌效果

從圖3可以看出，羌活提取物對番茄早疫病病原菌、灰葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌生長均有較明顯的抑制效果，不僅菌落擴(kuò)展半徑受到明顯抑制而且菌絲密度顯著降低，隨著提取物質(zhì)量濃度增加，抑制作用加強(qiáng)，呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。其中，對番茄早疫病病原菌的抑制最為明顯，10 mg/mL質(zhì)量濃度時抑制率達(dá)到73.63%；對灰葡萄孢菌的抑制強(qiáng)度相對降低，但菌落的擴(kuò)張仍受到明顯的抑制，10 mg/mL質(zhì)量濃度時抑制率為54.28%；值得一提的是，提取物對尖孢鐮刀菌的抑制也較為明顯，2.5 mg/mL質(zhì)量濃度時抑制率即達(dá)到28.98%。表3中計算出了羌活提取物對3種病原菌的毒力方程和EC50見表3，由表3可知，毒力方程的線性相關(guān)度較高。

試驗(yàn)所采用的3種病原菌是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中引起嚴(yán)重?fù)p失的重要種類，所寄生的作物涉及果樹、蔬菜、豆類、茶葉、花卉等百余種，危害較為嚴(yán)重[21-22]。結(jié)果表明，羌活地上部位提取物對3種病原菌均能夠起到較明顯抑制作用，同時也表明在提取物中存在對這3種菌有抑制活性的化合物，能夠?yàn)橹参锊∠x害的生物防治提供較為有效的研究材料，在部位有機(jī)食品及無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)中可以嘗試作為病蟲害的輔助防控手段，具備較大的應(yīng)用潛力和開發(fā)價值。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，羌活地上部位成分復(fù)雜，含有多種活性物質(zhì)，其中，揮發(fā)性成分中所含多種化合物被報道具有抑菌活性；非揮發(fā)性成分包括多種藥效物質(zhì)，其中羌活醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較為豐富。以往的研究更多的注重羌活入藥部位化學(xué)成分，也有部分涉及地上部位成分分析的，其實(shí)際利用的研究報道較少。在羌活的生產(chǎn)過程中，其地上部位被視為廢棄物丟棄，其化感效應(yīng)不僅可能造成其連作障礙，使農(nóng)田的覆蓋度下降，降低生態(tài)多樣性，給生態(tài)系統(tǒng)造成壓力，也是對植物資源的一種巨大浪費(fèi)。本研究以前期的理論為基礎(chǔ)，利用地上部分所含有的活性成分，將其利用于重要農(nóng)業(yè)病原菌中，處理過程簡單，對環(huán)境無污染，成本低廉，適合在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。研究結(jié)果為作物病蟲害生物防治的提供有效的材料和理論支撐[23- 24]，符合綠色和可持續(xù)農(nóng)業(yè)的概念，具有巨大的開發(fā)和利用價值。

圖3 不同濃度的提取物對病原真菌的抑制作用Fig.3 Inhibitions of different concentrations of extract to pathogenic fungi

病原菌Pathogen毒力回歸方程Toxic regression equationR2EC50 /(mg/mL)A. solaniy=―1.090+1.264 x0.9707.29B. cinerey=―1.989+1.729 x0.99314.14F. oxysporumy=―1.159+1.664 x0.9674.97