具殺蟲活性雷公藤內生菌的分離與篩選

張宏利，高保衛(wèi)，閆 合，馮俊濤 ，張 興

(1.西北農林科技大學，旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊陵 712100； 2.西北農林科技大學，無公害農藥研究服務中心，陜西楊陵 712100)

植物內生菌是指一類生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部的真菌或細菌,它們不僅包括互惠共利的和中性的內生共生微生物,也包括那些潛伏在宿主體內的病原微生物。植物內生菌可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織和汁液中分離獲得[1]。內生菌具有廣泛性與多樣性的特點，它們的代謝產物結構新穎、生物活性多樣，已受到醫(yī)藥學、農藥學和微生物學等多個領域的重視。從植物中篩選與開發(fā)具有農用價值的內生菌資源一直是新農藥開發(fā)的重要研究內容[2-3]。

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)為衛(wèi)矛科(Celastraceae)雷公藤屬(Tripterygium)植物，又名黃藤根、霹靂木、斷腸草等，廣泛分布于中國長江流域以南。該植物是傳統的植物源殺蟲劑，在民間很早即被用于害蟲防治。研究表明，雷公藤對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、蜚蠊目等多種昆蟲不僅表現出較強的毒殺作用,而且還有較強的拒食、麻醉、生長發(fā)育抑制和種群抑制等多種特異性殺蟲作用[4-7]。雷公藤殺蟲活性顯著，其活性成分為生物堿類化合物，但該類化合物主要分布于根皮，這從資源上限制了該植物在農業(yè)上的應用。因此，如果能從與雷公藤共生的內生菌或其代謝物中尋找到殺蟲活性成分，將會對該植物在農業(yè)上的應用奠定基礎。鑒于此，本研究對雷公藤內生菌進行分離培養(yǎng)，經活性篩選后，以期獲得殺蟲活性較高的菌株。

1 材料與方法

1.1 植物材料

雷公藤新鮮植株，2011年3月采于福建省，挑選無可見病斑的雷公藤(生長3 a)根、莖、葉，分別放入自封袋，帶回實驗室4 ℃保存，3 d之內進行分離。材料由西北農林科技大學生命科學學院李玉平副教授鑒定并保存于西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心，樣品編號為20130301。

1.2 供試昆蟲

桃蚜(Myzuspersicae)：采自西北農林科技大學附近農田桃樹葉片，為大小一致健康的蚜蟲。

鹵蟲(Artemiasaline)：孵化后約4 h的I期鹵蟲無節(jié)幼體，孵化條件為25 ℃持續(xù)光照24 h，由西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心提供。

淡色庫蚊(Culexpipienspallen)3齡幼蟲，25 ℃溫室培養(yǎng)，由西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心提供。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 內生真菌分離純化培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L。

麥芽膏培養(yǎng)基：麥芽膏15 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH 7.4～7.6。

雷公藤煎汁培養(yǎng)基：10 g植物樣品熬制成汁，加入PDA培養(yǎng)中，定容至1 L。

上述培養(yǎng)基含抗生素最終質量濃度為鏈霉素50 μg/mL、氯霉素40 μg/mL。

1.3.2 內生細菌分離純化培養(yǎng)基 TSA：胰蛋白胨15 g，大豆胨5 g，氯化鈉3 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

NBY：牛肉汁3.5 g，酵母膏2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，磷酸二氫鉀0.5 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂 15 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

NA：蛋白胨5 g，牛肉膏2.0 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂15 g，氯化鈉3 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

上述培養(yǎng)基含抗生素最終質量濃度為放線菌酮40 μg/mL。

1.3.3 內生放線菌分離純化培養(yǎng)基 高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，氯化鈉0.5 g，硝酸鉀1 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

HVA：腐殖酸1.0 g，碳酸鈣0.02 g，磷酸氫二鈉 0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鈉1.7 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，維生素B10.5 mg，維生素B20.5 mg，維生素B60.5 mg，生物素0.25 mg，煙酸0.5 mg，肌醇0.5 mg，泛酸0.5 mg，對氨基苯甲酸0.5 mg，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

水瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酪蛋白水解物4.0 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.2 g，二水氯化鈣0.1 g，檸檬酸鐵10 mg，七水硫酸鈷0.01 mg，五水硫酸銅0.1 mg，硼酸1.5 mg，水合硫酸錳0.8 mg，四水鉬酸銨0.2 mg，七水硫酸鋅0.6 mg，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

上述培養(yǎng)基含抗生素最終質量濃度為萘啶酸15 μg/mL、制霉菌素50 μg/mL。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基 內生真菌發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB(PDA培養(yǎng)基不加入瓊脂)，內生細菌發(fā)酵培養(yǎng)基為NB(NA培養(yǎng)基不加入瓊脂)，內生放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基為小米浸提液培養(yǎng)基(小米10 g，葡萄糖5 g，氯化鈉2 g，可溶性淀粉10 g，碳酸鈣2 g，pH 7.2～7.4)。

1.4 主要試劑

0.39 g/mL的次氯酸鈉溶液，φ=75%酒精，甘油，萘啶酸(上海晶純)，放線菌酮(科昊生物工程有限責任公司)，鏈霉素(西安舟鼎國生物技術公司)，氯霉素(科昊生物工程有限責任公司)。

1.5 主要儀器設備

ES-315高壓滅菌鍋(TOMY)、HPG-208B光照培養(yǎng)箱(哈爾濱東明器械廠)、ZHWY-2112B超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)、D8611超純水處理器(Barnstead)、U410低溫冰箱(New Brunswick Scientific)。

1.6 雷公藤植物材料的前處理及內生菌的分離

用自來水將無病斑的植物樣品沖洗30 min，葉直接摘下，將莖和根切成40 mm長的小段，根部樣品在超聲清洗儀中清洗1 min。無菌條件下先用φ=75%乙醇溶液浸泡樣品5 min，然后用有效氯質量濃度為3.125 mg/L的次氯酸鈉溶液浸泡 10 min，最后用φ=75%的乙醇浸泡1 min。消毒后的植物樣品在無菌水中沖洗3遍，用無菌濾紙吸干表面的沖洗液。表面消毒后，剪去根和莖的兩端，將木質部和韌皮部分開，棄去木質部，將韌皮部和葉片切成10 mm×10 mm的小段，用無菌手術刀片將組織塊劃傷，轉移到上述培養(yǎng)基上，有傷口的一面朝向培養(yǎng)基，每個平板接5～6片組織塊。平板上做相應的標記，在光周期L∶D=12∶12 的條件下培養(yǎng)15 d，光周期26 ℃，暗周期20 ℃。同時以最后一次沖洗樣品的無菌水，涂布于無菌平板，作為空白對照，以檢驗表面消毒的徹底性。

1.7 雷公藤內生菌的純化和保藏

待組織塊的邊緣有菌絲長出，挑取菌絲接于新的相應的培養(yǎng)基平板繼續(xù)培養(yǎng)，直到純培養(yǎng)，然后分別于4 ℃和-70 ℃冰箱中保存。

1.8 不同菌株內生菌對鹵蟲的殺蟲活性

稱取鹵蟲卵0.25 g于100 mL量筒中，用NaHCO3將人工海水(按表1配制)的pH調至8.0～8.5，取90 mL加入量筒中，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱內，用小型充氣泵從量筒的底部緩慢地充氣，使蟲卵保持懸浮，持續(xù)光照使其孵化。24 h后得到孵出約4 h的Ⅰ期鹵蟲的無節(jié)幼體，然后利用鹵蟲的趨光性，用吸管收集，備用。將上述人工海水培養(yǎng)24 h的鹵蟲用移液槍吸取100 μL到96孔板內，每孔蟲數為10～15頭，再加入100 μL無菌發(fā)酵液，每處理重復8次，20～25 ℃光照條件下培養(yǎng)，24 h后用解剖鏡檢查并記錄結果。

表1 人工海水配方Table 1 Formulation of artificial seawater

1.9 不同菌株內生菌對3齡蚊幼的殺蟲活性

發(fā)酵液對3齡蚊幼活性測試：分別取各菌株的無菌發(fā)酵液10 mL加入到25 mL燒杯中，再用紗網捕捉10頭3齡蚊幼分別加入燒杯中。每個處理重復3次，以未接種的無菌發(fā)酵液為空白對照，12 μg/mL雷公藤總堿為藥劑對照。

菌絲粗提物對蚊幼活性測試：取1.5 g菌絲得到的提取物用0.05 mL甲醇溶解，用蒸餾水定容至10 mL，即菌絲質量濃度為0.15 g/mL。搖勻后用紗網捕捉10頭3齡蚊幼，分別加入燒杯中。每個處理重復3次，以φ=0.5%甲醇溶液為空白對照，10 μg/mL雷公藤總堿為藥劑對照。置于養(yǎng)蟲室20～25 ℃，光周期L/D=12 h/12 h。在24 h時記錄并計算校正死亡率。

死亡率=死亡蟲數/供試試蟲總數×100%

校正死亡率=(處理死亡率-對照死亡率)/(1-對照死亡率)×100%

1.10 活性菌株發(fā)酵液萃取物及菌絲粗提物對桃蚜活性的測定

采用浸蟲浸液法。桃蚜采自桃樹，將帶蚜蟲的桃樹葉片基部用濕棉球保濕，鏡檢蚜蟲數量，保留生長發(fā)育較一致的蚜蟲，分別在粗提物(吐溫80體積分數為1%)中浸3～4 s，取出后用吸水紙吸干蚜蟲周邊的藥液，放置在培養(yǎng)皿中，每處理蚜蟲數為80～100頭。粗提物分別用φ=5%的甲醇溶解，菌絲粗提物質量濃度設定為(以菌絲的質量計) 0.15 g/mL，發(fā)酵液濃縮(以相對于原發(fā)酵液體積計)10倍，φ=5%的甲醇溶液為空白對照，30 μg/mL雷公藤總堿為藥劑對照。28 ℃、24 h 后鏡檢存活數，計算死亡率。

將上述方法得到的殺蚜活性較高菌株的菌絲粗提物設置5個質量濃度，同樣方法測定其毒力并計算LC50值。

2 結果與分析

2.1 雷公藤內生菌的分離

從雷公藤植株中共分離得到內生菌183株(表2)，其中真菌111株，放線菌23株，細菌49株。真菌比例最大，占總分離菌株數的60.66%，細菌占總分離株數的26.78%，放線菌占總分離株數的12.57%。雷公藤植株不同部位的內生菌數量有較大的差異，其中根部分離得到的內生菌最多(89株)，占總數的48.63%，葉部次之(72株)，占總數的39.35%，莖部分離得到的內生菌最少(22株)，占總數的12.02%。

表2 雷公藤不同組織內生菌的組成及分布Table 2 Isolation of endophytes from different tissue of Tripterygium wilfordii

2.2 不同菌株內生菌對鹵蟲的殺蟲活性

測定183株內生菌發(fā)酵液對鹵蟲的毒殺活性，24 h后檢查鹵蟲死亡情況，結果表明(表3)，鹵蟲死亡率在90%以上的有11-3-8、11-3-37、11-6-58、11-6-76、11-6-73等34株菌株，占供試菌株的18.58%，其中死亡率達到100%的有21株菌株，占供試菌株的11.48%。對鹵蟲有毒殺活性的菌株在雷公藤根部分布最多(表4)，共有19株，占分離總株數的10.93%；其次是葉部，有11株，占分離總株數的6.01%；莖部得到的活性菌株最少，僅3株，占分離總株數的1.64%。由表4可知，34株活性菌株中有33株真菌，1株放線菌。

表3 183株內生菌發(fā)酵液對鹵蟲的毒殺活性統計Table 3 Insecticidal activity against Artemia of 183 endophytes fermentation broth (24 h)

注：“-”為此處菌株編號略。下同。

Note: “-”O(jiān)mitting of the strain number.The same below.

表4 對鹵蟲有毒殺活性的菌株在植物不同組織的分布Table 4 Distribution of insecticidal activity against Artemia strains in different tissues

2.3 不同菌株內生菌對3齡蚊幼的殺蟲活性

183株內生菌發(fā)酵液對蚊幼活性測試結果顯示(表5)，10 μg/mL雷公藤總堿對蚊幼的毒殺效果為78.64%。24 h死亡率在70%以上的菌株有11-3-37、11-6-59、11-6-76、11-6-71等18株，占分離總株數的9.83%。對蚊幼有毒殺活性的菌株在雷公藤根部分布最多(表6)，共有13株，占分離總株數的7.10%；其次是葉部，有5株，占分離總株數的2.73%；莖部沒有得到活性菌株。從微生物類群上看，活性菌株主要是真菌。

表5 183株內生菌發(fā)酵液對3齡蚊幼的毒殺活性統計(24 h)Table 5 Insecticidal activity against 3rd instar larvae of Culex pipiens of 183 endophytes fermentation broth(24 h)

注：10 μg/mL雷公藤總堿為藥劑對照，對蚊幼的毒殺效果為78.64%。

Note: 10 μg/mL alkaloids ofTripterygiumfor pharmaceutical control,the mortality rate on the larvae ofCulexpipienswas 78.64%.

表6 對3齡蚊幼有毒殺活性的菌株在植物不同組織的分布Table 6 Distribution of insecticidal activity against 3rd instar larvae of Culex pipiens strains in different tissues

從以上結果可知，有34株菌株發(fā)酵液對鹵蟲有較高的活性，其中有18株同時對蚊幼有較高的毒殺活性。經過多次發(fā)酵試驗驗證這18株菌株對蚊幼的毒殺活性相對穩(wěn)定，可以作為下一步殺蟲活性研究的供試菌株。這些菌株的發(fā)酵液對鹵蟲和蚊幼的毒殺效果都在70%以上，其中有11株菌株發(fā)酵液對蚊幼的毒殺活性達到100%，高于10 μg/mL雷公藤總堿對蚊幼的毒殺效果(78.64%)。從活性菌株在植物的不同組織分布上看，活性菌株主要集中在根部組織和葉部組織，分別占分離總株數的7.10%和2.73%，莖部組織沒有活性菌株分布。從微生物類群上看，活性菌株中有17株真菌和1株放線菌，分別占分離總株數的9.29%和0.54%，真菌占絕大多數。

2.4 18株內生菌發(fā)酵產物對桃蚜的殺蟲活性

采用浸蟲浸液法測試18株內生菌發(fā)酵產物對蚜蟲的毒殺活性，結果表明6株內生菌具有一定殺蚜蟲活性，其中11-6-76、11-6-71和11-2-43菌株的菌絲粗提物殺蚜活性較高，處理24 h后蚜蟲的死亡率分別為70.75%、66.83%和60.95%；11-3-37、11-6-76、12-2-47和11-2-43菌株的發(fā)酵液也具有較高的殺蚜活性，處理24 h后蚜蟲的死亡率分別為82.74%、78.64%、76.97%和64.48%。11-6-76 和11-2-43 菌株的發(fā)酵液和菌絲粗提物均具有較高的殺蚜活性(表7)。

2.5 3株內生菌菌絲粗提物的殺蚜活性毒力測試

對殺蚜活性較好的3株菌株12-2-47、11-6-76和11-3-37的菌絲粗提物進行毒力測定，結果顯示(表8)，菌株11-3-37、11-6-76 和12-2-47菌絲粗提物對蚜蟲的LC50分別為34.8 mg/mL，31.2 mg/mL和46.4 mg/mL。

通過用粗提物測試殺蚜活性結果得到2株活性較好的菌株，其中菌株11-6-76的發(fā)酵液和菌絲粗提物均有較高的活性，死亡率分別為 78.64%和70.75% ，菌株11-3-37的菌絲粗提物對蚜蟲的毒殺活性也比較好，死亡率為82.74%，活性均高于藥劑對照。

表7 不同菌株內生菌代謝產物的殺蚜活性(24 h)Table 7 Insecticidal activity of strains crude extracting agaist Myzus persicae(24 h)

注：試驗所設對照死亡率為0，同列死亡率后的不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)。

Note：Control mortality is 0，column followed by different letters were significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple rang test.

表8 3株菌株胞內代謝產物殺蚜活性測定(24 h)Table 8 Insecticidal activity of 3 strains crude extracting agaist Myzus persicae(24 h)

注：毒力方程中x為質量濃度對數，y為死亡率機率值。

Note: In the virulence equation,xis logarithm of mass concentration andyrepresents mortality probability.

3 討 論

本研究表明，雷公藤組織內存在豐富的內生菌，不同組織內生菌的數量、種類有一定差異，在具有殺蟲活性的菌株中,放線菌占的比例最高。通過對雷公藤組織處理的消毒液進行培養(yǎng)，發(fā)現培養(yǎng)基上無菌落生長，表明本研究中所分離得到的菌株為雷公藤組織內的內生菌。

目前，對雷公藤內生菌的研究主要集中在內生真菌上，對內生細菌和放線菌的分離研究較少。對菌株活性的研究也主要集中在醫(yī)藥領域，農用活性的相關研究只有很少的文獻報道，且僅限于抑菌活性的相關研究。宋萍等[8]從雷公藤不同組織器官中共分離得到22株不同形態(tài)型的內生真菌，組織部位包括植株的根、莖、葉，其中植株枝中的分離數量高于根和葉。22株內生真菌中大多數都具有一定程度的抑菌活性。通過對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等的活性篩選，發(fā)酵液提取物的抑菌活性好于菌絲體提取物，并得到對病原真菌具有較好抑制作用的內生真菌。申屠旭萍等[9]從雷公藤植株中分離得到36株內生真菌，通過活性篩選得到一株對黃瓜立枯病菌、水稻紋枯病菌、葡萄炭疽病菌、黃瓜枯萎病菌等均具有較好抑制效果的內生真菌。隨著對藥用植物資源研究的深入，寄生于藥用植物體內的內生菌不斷被發(fā)現，他們不但對寄主植物次生代謝產物的產生具有一定的促進作用，而且自身也會產生與植物活性物質相同或類似的物質。例如，王梅霞等[10]報道一株從銀杏中分離的內生真菌EG4的次生代謝物中含有黃酮。

本研究通過對雷公藤內生菌殺蟲活性的篩選發(fā)現其中部分菌株發(fā)酵液具有較好的殺蟲活性，它們的殺蟲活性是否與發(fā)酵產物含有雷公藤生物堿有關需要做進一步的分離驗證。