小鼠胚胎電轉(zhuǎn)外源物質(zhì)條件的優(yōu)化

樊英智，鄔明麗，李世鵬，高 源，賴振雨，雷初朝，黨瑞華

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA、RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法有很多：生物學(xué)方法(即以病毒為載體的轉(zhuǎn)染方法)、化學(xué)方法(磷酸鈣共沉淀法、EDTA-葡聚糖法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法、陽(yáng)離子聚合物法)、物理方法(顯微注射法、基因槍法、電穿孔法、激光照射法、聲孔效應(yīng)法、磁性納米顆粒等)。其中大部分方法對(duì)設(shè)備和操作的要求都較高，且效率不高。而電穿孔技術(shù)是利用電流來(lái)增加細(xì)胞膜的可透性，高效快速地將外源物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，操作簡(jiǎn)便，效率較高[1-3]。目前，新興的CRISPR/Cas9技術(shù)具有高度適應(yīng)性、組裝簡(jiǎn)便性、高特異性，成為當(dāng)前最常用的基因組編輯方法，通過(guò)電轉(zhuǎn)可以將編輯組件導(dǎo)入胚胎實(shí)施精確編輯，進(jìn)一步推動(dòng)在實(shí)踐中的應(yīng)用，但此方面的研究鮮見報(bào)道。由于mRNA具有不穩(wěn)定性，且電轉(zhuǎn)需將構(gòu)建的mRNA置于靶細(xì)胞所處的環(huán)境中，但mRNA在該環(huán)境易被分解，這給試驗(yàn)帶來(lái)極大的不便[4]。另外，體外轉(zhuǎn)錄法獲得mRNA成本相對(duì)較高。因此，本研究以大分子熒光染料四甲基羅丹明標(biāo)記的葡聚糖(Tetramethylrhodamine-labelled dextran)、帶綠色熒光蛋白標(biāo)記的質(zhì)粒pLL3.7、體外轉(zhuǎn)錄的綠色熒光蛋白mRNA作為替代基因編輯組件的外源物質(zhì)，探索電穿孔法將外源物質(zhì)導(dǎo)入小鼠胚胎的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)pLL3.7質(zhì)粒中eGFP(enhanced green fluorescent protein)基因的CDS區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。其中，上游引物包含T7啟動(dòng)子序列。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 eGFP的CDS區(qū)引物序列Table 1 Primer sequence of eGFP-CDS

1.2.2eGFP質(zhì)粒的準(zhǔn)備 將帶有eGFP標(biāo)記的pLL3.7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，并用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。然后進(jìn)行質(zhì)粒提取，分裝后-80 ℃ 冰箱過(guò)夜，再用冷凍干燥機(jī)凍干，在-20 ℃冰箱保存，備用。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 對(duì)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，然后在37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至90% 融合時(shí)，進(jìn)行傳代。再轉(zhuǎn)移到37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 pLL3.7質(zhì)粒和eGFPmRNA表達(dá)效率驗(yàn)證 轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞按每孔2×105個(gè)細(xì)胞鋪于24孔板中。轉(zhuǎn)染時(shí)DNA/RNA(μg)和轉(zhuǎn)染試劑(μL)用量為1∶2.5最佳[5]。RNA轉(zhuǎn)染時(shí)，所用器械、槍頭、EP管等均為RNA級(jí)。

1.2.6 熒光染料的準(zhǔn)備 用滅菌的PBS溶解四甲基羅丹明標(biāo)記的葡聚糖(Tetramethylrhodamine-labelled dextran)，制備2 mg/mL的溶液，按每管30 μL分裝在滅菌的PCR管中，-20 ℃長(zhǎng)期保存(避光，避免反復(fù)凍融)。

1.2.7 小鼠超排 選取8～15周齡的健康雌鼠，腹腔注射0.5 mL PMSG(激素孕馬血清促性腺激素，10 u/mL)。48 h后每只雌鼠腹腔注射0.5 mL hCG(人絨毛膜促性腺激素，10 u/mL),然后雌雄鼠同籠。16 h后檢查雌鼠是否出現(xiàn)陰道栓，出現(xiàn)陰道栓說(shuō)明受孕成功，此時(shí)胚齡定為0.5 d，再經(jīng)過(guò)24 h，為1.5 d。

1.2.8 小鼠胚胎采集和電轉(zhuǎn) 采集0.5 d受精卵：查明有陰道栓當(dāng)天，在解剖室脫頸處死小鼠，剪開腹腔，掀開內(nèi)臟，暴露子宮，剪取子宮和卵巢之間的輸卵管后，放在盛有PBS的培養(yǎng)皿中。在解剖鏡下用PBS清洗3次，用解剖針挑破輸卵管上部膨大部分，游離出團(tuán)塊狀受精卵，即為0.5 d胚胎，解剖鏡下觀察到胚胎處于1細(xì)胞期； 如采集1.5 d受精卵：在查明有陰道栓之后，將成功受孕的雌鼠分籠飼養(yǎng)，24 h后脫頸處死小鼠，剪取子宮和卵巢之間的輸卵管后，放在盛有PBS的培養(yǎng)皿中，PBS清洗3次，用注射器吸取少量PBS，找到輸卵管的上方開口，將注射器插入輸卵管開口處，將PBS溶液注射進(jìn)輸卵管中，利用沖力沖出受精卵，可在解剖鏡下觀察到胚胎處于2細(xì)胞期。

將電轉(zhuǎn)儀上的參數(shù)設(shè)置好，準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)。將采集到的0.5 d的小鼠受精卵團(tuán)塊迅速放在透明質(zhì)酸酶中消化38 s。在解剖鏡下觀察到受精卵基本散開時(shí)，利用制備好的轉(zhuǎn)移工具將胚胎轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)液中，清洗3次； 1.5 d的小鼠胚胎直接用電解液清洗3次。最后將帶有電轉(zhuǎn)液的胚胎轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)槽中，利用更細(xì)的針將多余的電轉(zhuǎn)液吸出，迅速加入用電轉(zhuǎn)液稀釋的待電轉(zhuǎn)溶液(含有羅丹明染料、eGFPmRNA和eGFP質(zhì)粒)。啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，同時(shí)在解剖鏡下觀察極板之間是否出現(xiàn)氣泡，以此作為電轉(zhuǎn)成功標(biāo)志。然后迅速將胚胎和電轉(zhuǎn)液一同吸出，用M16培養(yǎng)基清洗3～6次，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基液滴中培養(yǎng)，加入礦物油將其完全覆蓋。培養(yǎng)皿置于37 ℃、φ=5% CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 分別觀察電轉(zhuǎn)羅丹明染料、eGFPmRNA和eGFP質(zhì)粒后24 h的胚胎發(fā)育情況及熒光率，統(tǒng)計(jì)并分析相同脈沖電壓條件下0.5 d和1.5 d胚胎的熒光率，以及相同細(xì)胞期不同電轉(zhuǎn)電壓的胚胎熒光率。使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 pLL3.7質(zhì)粒和eGFP mRNA表達(dá)效率驗(yàn)證

pLL3.7質(zhì)粒攜帶eGFP標(biāo)簽，質(zhì)粒大小為7 649 bp，與預(yù)期一致，如圖1(右)所示。PCR得到帶T7啟動(dòng)子的eGFP-CDS，片段大小為979 bp，與預(yù)期一致，如圖1(左)所示。eGFPmRNA體外轉(zhuǎn)錄如圖2 所示，片段大小為783 bp，與預(yù)期一致。

左圖為eGFP模板檢測(cè) Left picture indicates detection of eGFP-CDS；M.DNA marker DL2000；1.coGFP質(zhì)粒 coGFP plasmid；2.pLL3.7質(zhì)粒 pLL3.7 plasmid；右圖為pLL3.7eGFP質(zhì)粒檢測(cè) Right picture indicates detection of pLL3.7eGFP；M.DNA marker DL 15000；1～2.pLL3.7質(zhì)粒 pLL3.7 plasmid

圖1eGFPpLL3.7質(zhì)粒及體外轉(zhuǎn)錄模板檢測(cè)
Fig.1DetectionofeGFPpLL3.7plasmidandtemplatesforinvitrotranscription

M.DNA marker DL2000；1.eGFPpLL3.7 mRNA 加尾后 TheeGFPpLL3.7 mRNA with tail；2.eGFPpLL3.7 mRNA 未加尾片段 TheeGFPpLL3.7 mRNA without tail

圖2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測(cè)
Fig.2Detectionoftranscriptionproduct

pLL3.7質(zhì)粒和eGFPmRNA制備完成后，以相同濃度使用DfectorTM、RfectorTM(上海吉熒)轉(zhuǎn)染劑轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后利用熒光顯微鏡拍照，結(jié)果見圖3，環(huán)狀質(zhì)粒熒光率約為70%，eGFPmRNA熒光率約為50%，對(duì)照組與試驗(yàn)組經(jīng)過(guò)相同的轉(zhuǎn)染步驟，轉(zhuǎn)染液中未加外源物質(zhì)。以上結(jié)果說(shuō)明pLL3.7質(zhì)粒和eGFPmRNA在HEK293T細(xì)胞中能高效正常工作，可用于胚胎電轉(zhuǎn)。

2.2 電穿孔法將熒光染料、eGFP質(zhì)粒和eGFP mRNA導(dǎo)入小鼠胚胎的條件優(yōu)化

正常胚胎形態(tài)飽滿，0.5 d為1細(xì)胞期，1.5 d為2細(xì)胞期，2.5 d為4細(xì)胞期，3.5 d為8細(xì)胞期；而異常的胚胎會(huì)出現(xiàn)不均等分裂、細(xì)胞核固縮等現(xiàn)象。0.5 d的小鼠胚胎由卵丘細(xì)胞包裹成團(tuán)，需要用透明質(zhì)酸酶將包裹在胚胎周圍的卵丘細(xì)胞消化開。將熒光染料電轉(zhuǎn)導(dǎo)入胚胎后，立即用熒光顯微鏡觀察，判斷其是否成功導(dǎo)入，然后立刻放回培養(yǎng)箱。24 、48 h后繼續(xù)觀察胚胎發(fā)育情況，記錄電穿孔后胚胎熒光率及發(fā)育情況。

分別采集0.5 d和1.5 d胚胎，根據(jù)參考文獻(xiàn)[6-8]設(shè)計(jì)不同脈沖電壓，相同的電轉(zhuǎn)間隔：電轉(zhuǎn)電壓X V，脈沖長(zhǎng)度0.5 ms，脈沖間隔50 ms，脈沖次數(shù)3次，衰減率10%(+)。電轉(zhuǎn)電壓10 V，脈沖長(zhǎng)度50 ms，脈沖間隔50 ms，脈沖3次，衰減率40%(+ -)。

電轉(zhuǎn)羅丹明染料(2.0 mg/mL)進(jìn)入胚胎，24 h 后胚胎發(fā)育情況如表2所示。在0.5 d的胚胎中，80、90 V均未能將羅丹明導(dǎo)入胚胎，110、150 V 雖然能將羅丹明導(dǎo)入胚胎，但最終沒(méi)有正常發(fā)育。在1.5 d胚胎中，50 V未能將羅丹明導(dǎo)入，80 V只有極個(gè)別胚胎導(dǎo)入羅丹明，但隨后正常發(fā)育的胚胎中未見有羅丹明；110 V時(shí)羅丹明的導(dǎo)入率約為63%，但其中只有部分胚胎能正常發(fā)育，最終導(dǎo)入羅丹明的胚胎存活率為27%；而當(dāng)電壓為150 V時(shí)，雖然羅丹明導(dǎo)入率有所提升，但正常發(fā)育的胚胎急劇下降，且最終發(fā)育正常的胚胎中未發(fā)現(xiàn)羅丹明。

圖3 pLL3.7質(zhì)粒和eGFP mRNA活性驗(yàn)證Fig.3 Validation of pLL3.7 vector and eGFP mRNA expression

胚齡/d Stage脈沖電壓/V Voltage檢測(cè)的胚胎數(shù)量Number of detected embryos胚胎正常分裂率a/%Embryo normally division rate熒光率bFluorescence rate0.58080090802511016044150260381.58014717901087101101394461501238

注：a表示3.5 d正常發(fā)育至8～16細(xì)胞期的胚胎數(shù)與總胚胎數(shù)之比，取個(gè)位數(shù)。b表示電穿孔1 d后胚胎熒光率。下同。

Note: a.3.5 days ratio of number of embryos that normally develop to 8-16 cell stage to total number of embryos,in single digits.b.Embryo fluorescence rate one day after electroporation.The same below.

分別電轉(zhuǎn)eGFP質(zhì)粒(2.2 μg/μL)及eGFPmRNA(420 ng/μL)進(jìn)入胚胎，24 h后胚胎發(fā)育情況如表3和4所示,低電壓電轉(zhuǎn)后胚胎發(fā)育較好。高電壓條件下，胚胎大多無(wú)法正常發(fā)育。無(wú)論何種電壓，eGFP質(zhì)粒均不能被導(dǎo)入。eGFPmRNA在高電壓情況下可導(dǎo)入0.5 d胚胎，但不能正常發(fā)育。

表3 電轉(zhuǎn)eGFP質(zhì)粒后胚胎發(fā)育情況Table 3 Embryo development after introducing eGFP plasmid

表4 電轉(zhuǎn)eGFP mRNA后胚胎發(fā)育情況Table 4 Embryo development after introducing eGFP mRNA

3 討 論

目前，常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染效率較低、成本高，能用于轉(zhuǎn)染胚胎的很少[9-12]。電穿孔轉(zhuǎn)染法的作用機(jī)制是在高強(qiáng)度電脈沖條件下使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其膜上出現(xiàn)孔道，該孔道具有暫時(shí)性、親水性以及可逆性特點(diǎn)，促使大分子物質(zhì)可進(jìn)入靶細(xì)胞，這種轉(zhuǎn)染方式操作簡(jiǎn)便，且具有較高的轉(zhuǎn)染率，通用性強(qiáng)，成本相對(duì)較低[7-8]。

本研究探索電穿孔法將外源物質(zhì)導(dǎo)入小鼠胚胎的最優(yōu)條件,先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)即pLL3.7質(zhì)粒和eGFPmRNA的表達(dá)效率驗(yàn)證。結(jié)果顯示，pLL3.7質(zhì)粒和eGFPmRNA均能在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)，但pLL3.7質(zhì)粒的綠色熒光明顯較eGFPmRNA強(qiáng)，已知在轉(zhuǎn)染相同濃度的核酸條件下，熒光強(qiáng)度受轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)效率的影響。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和mRNA使用的是吉熒生物的轉(zhuǎn)染試劑，該試劑對(duì)這2種轉(zhuǎn)染物質(zhì)的轉(zhuǎn)染效率均較高。推測(cè)eGFPmRNA在操作過(guò)程中存在一定程度的降解，但eGFPmRNA能夠在細(xì)胞中表達(dá)，說(shuō)明設(shè)計(jì)的體外轉(zhuǎn)錄體系正確。

本研究分別用0.5 d和1.5 d的小鼠胚胎探索電穿孔法導(dǎo)入外源物質(zhì)的最佳條件。試驗(yàn)使用熒光染料和綠色熒光蛋白作為觀察的標(biāo)記物代替基因編輯組件，這樣可省略突變檢測(cè)環(huán)節(jié)，大大簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作，縮短試驗(yàn)周期。試驗(yàn)首先選擇的熒光染料是質(zhì)量濃度為2 mg/mL的羅丹明。結(jié)果顯示(表2)，110 V是較理想的電壓條件(P<0.05)，且1.5 d的胚胎比0.5 d的胚胎更耐受電刺激，同樣的電壓條件下，1.5 d的胚胎存活率明顯較0.5 d高(P<0.05)。然后將攜帶eGFP熒光標(biāo)記的pLL3.7質(zhì)粒作為外源物質(zhì)進(jìn)行離體胚胎電穿孔試驗(yàn)。雖然pLL3.7質(zhì)粒質(zhì)量濃度已達(dá)2.2 μg/μL，試驗(yàn)用110、150 V甚至更高的220 V電壓，但結(jié)果均顯示pLL3.7質(zhì)粒未能被導(dǎo)入胚胎并表達(dá)，原因可能是質(zhì)粒分子較大，而0.5 d 胚胎有透明帶保護(hù)，質(zhì)粒不易導(dǎo)入。最后，本研究嘗試將體外轉(zhuǎn)錄得到的eGFPmRNA(電轉(zhuǎn)質(zhì)量濃度為420 ng/μL)通過(guò)電穿孔的方法導(dǎo)入胚胎，在用215 V高電壓將mRNA導(dǎo)入0.5 d胚胎后，可以觀測(cè)到綠色熒光，說(shuō)明mRNA分子較小，能夠進(jìn)入胚胎并正常表達(dá)，但在胚胎后期發(fā)育中，沒(méi)有正常分裂的胚胎，多數(shù)呈畸形，可能是高電壓影響胚胎正常發(fā)育。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在體外通過(guò)電穿孔法將外源物質(zhì)導(dǎo)入胚胎時(shí)的最佳電轉(zhuǎn)條件為：電轉(zhuǎn)電壓110 V，脈沖長(zhǎng)度0.5 ms，脈沖間隔50 ms，脈沖3次，衰減率10%(+)；電轉(zhuǎn)電壓10 V，脈沖長(zhǎng)度50 ms，脈沖間隔50 ms，脈沖次數(shù)3次，衰減率40%(+ -)。電壓過(guò)高或過(guò)低均會(huì)導(dǎo)致電轉(zhuǎn)效率或后期成活率顯著下降，且1.5 d的胚胎(2細(xì)胞期)比0.5 d的胚胎(1細(xì)胞期)更適合電轉(zhuǎn)。