新疆天池放線菌的分離及其抑菌活性

王秀爽，田江麗，邵勝楠，崔志浩，潘崇樂，張國強

(1.石河子大學 農學院，新疆石河子 832003；2.石河子大學 生命科學學院，新疆石河子 832003)

放線菌是一類極具開發(fā)價值的微生物，它不僅能夠產生多種抗生素[1]，還能代謝產生極具商用價值的多糖或蛋白質類物質[2]，其中不乏一些具有農用開發(fā)價值的生物活性物質。因此，放線菌資源的挖掘一直是各國學者關注的焦點。植物病害嚴重威脅著中國農業(yè)生產，以放線菌為基礎開發(fā)微生物源農藥既可在一定程度上挽回病害損失，還能降低對環(huán)境的污染。中國新疆地域廣闊，擁有多種特殊的自然環(huán)境，蘊藏著豐富的微生物資源。因此，深入挖掘新疆微生物資源，開發(fā)具有新疆特色的微生物源農藥，對中國植保領域的發(fā)展具有重要意義。近年來國內外多家科研單位對新疆放線菌資源開展深入挖掘工作，主要對羅布泊、艾比湖、于田鹽池、哈密鹽湖等干旱或高鹽環(huán)境中的放線菌進行研究[3-8]，發(fā)現(xiàn)大量放線菌新種，如Streptomycesluteus、Nocardiopsisakesuensis、Saccharothrixlopnurensis、Glycomycesxinjiangensis等[9-12]。然而，對于這些新疆特色放線菌的農用活性研究相對較少，加之國內外對新疆放線菌資源的挖掘主要集中在南疆的荒漠和鹽湖地區(qū)，對天山天池地區(qū)放線菌資源的農用活性研究則更為稀少。因此，有必要開展新疆天池放線菌資源挖掘及農用活性研究。本研究對天池地區(qū)土壤樣品中的放線菌進行選擇性分離，結合離體和活體試驗篩選對植物病原菌具有抑制作用的放線菌，并進行初步分類鑒定，以期獲得具有研究與開發(fā)價值的資源放線菌，為開發(fā)新疆特色微生物源農藥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品 采自新疆天池地區(qū)(海拔1 900 m 左右，88.12～88.15°N，43.85～43.92°E，采集時間為2016年12月)的12份土壤樣品，按照土壤類型混合為4種土樣，分別為砂土、壤土、草甸土以及河底泥土，陰干，備用。

1.1.2 分離及純化培養(yǎng)基 GA培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.05 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH為7.4～7.6。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH為7.4～7.6。

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH為7.4～7.6。

TPA培養(yǎng)基：海藻糖5 g，脯氨酸1 g，(NH4)2SO41 g，NaCl 1 g，CaCl22 g，K2HPO41 g，ZnSO4·7H2O 1 g，硫胺素50 μg，核黃素50 μg，煙酸50 μg，泛酸鈣50 μg，維生素B650 μg，肌醇50 μg，對-氨基苯甲酸50 μg，生物素25 μg，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH為7.2。

HVA培養(yǎng)基：腐殖酸1 g，CaCO30.02 g，Na2HPO40.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，KCl 1.7 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，硫胺素50 μg，核黃素50 μg，煙酸50 μg，泛酸鈣50 μg，維生素B650 μg，肌醇50 μg，對-氨基苯甲酸50 μg，生物素25 μg，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH為7.4。

CA培養(yǎng)基：幾丁質4 g，K2HPO40.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 1 mg，瓊脂20 g，硫胺素50 μg，核黃素50 μg，煙酸50 μg，泛酸鈣50 μg，維生素B650 μg，肌醇50 μg，對-氨基苯甲酸50 μg，生物素25 μg，蒸餾水1 L，pH為7.4。

GB培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.05 g，蒸餾水1 L，pH為7.4～7.6。

1.1.3 抑制劑 放線菌酮和萘啶酸均為分析純試劑。

1.1.4 供試病原菌 立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、番茄灰霉病原菌(Botrytiscinerea)，由石河子大學農學院植物病理實驗室提供。

1.1.5 供試種子 黃瓜種子(‘荷蘭35’，感病品種)，由新疆建設兵團第十師北屯市農科所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 土樣采集方法 在每個采樣地區(qū)選取多個采樣點，采用蛇形采樣法進行取樣，土層深度為0～5 cm。取樣品200～500 g采用四分法進行混合。將所采土樣裝入布袋或聚乙烯塑料袋，內外均應附標簽，標明采樣編號、名稱、采樣深度、采樣地點、日期、采集人等信息。

1.2.2 土樣中微生物含量測定方法 稱取0.5 g風干土樣，用無菌水系列稀釋至10-4，取100 μL分別按照以下方式處理：細菌在28～30 ℃條件下用NA培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)，放線菌用GA培養(yǎng)基培養(yǎng)，真菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用平板計數(shù)法統(tǒng)計每克干土中細菌、放線菌和真菌的個數(shù)。

1.2.3 土壤放線菌分離方法 將供試土樣風干磨碎過200目篩后，采用3種方法進行處理：(1)稱取0.5 g風干土樣，置于10 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.0)中30 ℃處理60 min，1 500 g離心20 min，然后靜置10 min，取上清液系列稀釋至10-4后取100 μL涂于分離培養(yǎng)基平板上分別于4 ℃和22 ℃培養(yǎng)15～30 d，挑出放線菌后于GA培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。(2)稱取0.5 g風干土樣，置于1.5%苯酚(5 mmol/L磷酸緩沖液pH=7.0配置)中30 ℃處理20 min 后取上清液系列稀釋至10-4，取100 μL涂于分離培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)15～30 d，挑出放線菌后于GA培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。(3)稱取0.5 g風干土樣，用無菌水懸浮后，系列稀釋至10-4，取100 μL涂于分離培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)15～30 d，挑出放線菌后于GA培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。所有分離培養(yǎng)基內均含有50 mg/L放線菌酮和50 mg/L萘啶酸。

1.2.4 放線菌發(fā)酵液制備 將放線菌接種于GA培養(yǎng)基平板上，27 ℃培養(yǎng)5～7 d，取8個6 cm菌餅接種至GB液體培養(yǎng)基(100 mL)中，28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)5～7 d，取上清過0.45 μm 無菌濾膜后備用。

1.2.5 抑菌活性測定 對峙法：在培養(yǎng)皿上穿過中心作一條線，將放線菌接種于線上1/3處，28 ℃培養(yǎng)2～3 d至完全定殖后，將病原真菌菌塊接種至放線菌菌落對稱位置，繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d 后，測量放線菌菌落之間的真菌菌落寬度。

牛津杯法：在GA培養(yǎng)基平板表面直接對稱放置2個牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。在杯中加入200 μL發(fā)酵液無菌濾液，在2個牛津杯中間接種病原真菌，28 ℃培養(yǎng)3 d后測量抑菌圈直徑。

盆栽法：取籽粒飽滿的黃瓜種子在φ=75%乙醇中表面消毒3 min，用無菌水清洗3次，然后放于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于30 ℃條件下催芽48 h。試驗使用的土壤中含有立枯病菌1.5 g/kg。試驗時將10粒黃瓜種子淺播于花盆中，并加入20mL放線菌菌株發(fā)酵液。設無菌水為對照，每個處理重復3次。每隔3 d加1次發(fā)酵液，培養(yǎng)9 d時檢查植株發(fā)病率、株高以及發(fā)芽率。

1.2.6 放線菌鑒定 形態(tài)學鑒定：采用插片法[13]在GA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)放線菌3～5 d后，在400倍電子顯微鏡下觀察菌絲及孢子絲形態(tài)，然后利用鑒定手冊進行分類鑒定[14]。

放線菌菌株在GB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(全式金，中國)進行放線菌基因組DNA提?。皇褂猛ㄓ靡?7F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACG- ACTT5-3′)，結合EasyTaqPCR SuperMix(全式金，中國)進行16S rDNA進行擴增；PCR反應程序為： 94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火2 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次，72 ℃再延伸10 min。反應結束后進行電泳檢測， PCR產物由上海生工生物工程有限公司進行純化與測序。測序結果進行BLAST，選取相似度較高的菌株序列，利用MEGA7.0進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建(使用NJ法建樹，Bootstrap法進行1 000次重復，利用Kimura 2-parameter法計算進化距離)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS19軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncun’s新復極差法對數(shù)據(jù)進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 天池地區(qū)不同類型土壤中的微生物含量差異

新疆天池地區(qū)的4類土壤樣品中含有大量微生物，包括真菌、細菌和放線菌。從表1可看出，4種土壤樣品中細菌含量最高，其次為放線菌，真菌最少。其中草甸土中放線菌數(shù)量最多，為1.58×108CFU/g。而砂土中的放線菌數(shù)量最少，為2.67×107CFU/g。

表1 天池地區(qū)不同類型土壤微生物含量Table 1 Microbial content in differentsoil types of Tianchi

2.2 天池放線菌的分離與純化

采用2種預處理方法和3種分離培養(yǎng)基對供試的4類土壤樣品中放線菌進行選擇性分離，共分離得到213株放線菌。從表2可以看出，草甸土樣品中分離得到的放線菌數(shù)量最多，壤土次之，兩者得到的放線菌數(shù)量分別為86株和79株，占放線菌分離總數(shù)的40.38%和37.09%。

表2 各土樣中放線菌的分離情況Table 2 Data of actino mycetei solation from soil samples

2.3 天池放線菌的抑菌活性

采用菌株對峙法測定213株放線菌對立枯絲核菌和番茄灰霉病菌的拮抗作用，結果發(fā)現(xiàn)有14株放線菌對立枯絲核菌的拮抗效果在70%以上(表3)，8株放線菌對番茄灰霉病菌的拮抗效果在60%以上(表4)。其中有5株放線菌(TC-33、TC-50、TC-52、TC-95和TC-174)對立枯絲核菌和番茄灰霉病菌均具有抑制作用。

表3 14株放線菌對立枯絲核菌的抑制效果(對峙法)Table 3 Inhibition of 14 strains against R.solani(Antagonistic method)

注：數(shù)據(jù)后標有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Note：Values followed by the different letters in the same column are significantly different(P<0.05).The same below.

表4 8株放線菌對番茄灰霉病菌的抑制效果(對峙法)Table 4 Inhibition of eight strains against B.cinerea(Antagonistic method)

利用牛津杯法對5株放線菌的菌株代謝物的抑菌活性進行測定，結果顯示該5株放線菌的代謝物對立枯絲核菌和番茄灰霉病菌均具有較強的抑制作用(表5)，說明抑菌活性物質主要為胞外代謝產物。

利用盆栽法測定5株放線菌對黃瓜立枯病的防治效果，結果顯示放線菌TC-33、TC-50和TC-95的菌株代謝物對黃瓜立枯病均具有較好的防治效果(圖1-A)，其中TC-50菌株代謝物的防效最高，為89.98%。在試驗中發(fā)現(xiàn)TC-50發(fā)酵液可促進黃瓜幼苗生長(圖1-B)，而TC-95發(fā)酵液對黃瓜幼苗生長具有一定的抑制作用。3株放線菌的代謝物均可提高黃瓜種子在含菌土壤中的發(fā)芽率，尤其是TC-50，其菌株發(fā)酵液可使種子發(fā)芽率提高90%以上(圖1-C)。

表5 5株放線菌發(fā)酵液對2種病原菌的 抑制作用(牛津杯法)Table 5 Inhibition of five strain’s metabolites against two pathogenic fungi (Oxford-cup method)

2.4 放線菌TC-50初步鑒定

經過形態(tài)學觀察，放線菌TC-50菌落為灰白色、干燥、絨狀、無色素產生(圖2-A)，氣生菌絲豐富，孢子絲為直線形，孢子呈橢圓形(圖2-B)，屬于灰白色放線菌類群；利用分子手段對放線菌TC-50進行分子鑒定，結果顯示TC-50與StreptomyceschumphonensisKK1-2(NR_126175)親緣關系最近(84%)，其序列相似達98%(圖3)，結合形態(tài)學分析，最終確定放線菌TC-50歸屬于鏈霉菌(Streptomycessp.)。

A.菌株代謝物對黃瓜立枯病的防治效果 Effects of strain’s metabolites againstRhizoctoniarot；B.菌株代謝物對黃瓜幼苗株高的影響 Effects of strain’s metabolites on plant height of cucumber；C.菌株代謝物對黃瓜種子發(fā)芽及生長的影響 Effects of strain’s metabolites on germination and growth of cucumber seeds；D.對照 Control

圖13株放線菌菌株代謝物對黃瓜立枯病的防治效果及對黃瓜幼苗生長的影響
Fig.1Effectsofthreestrain’smetabolitesonRhizoctoniarotandseedlinggrowthofcucumber

圖2 放線菌TC-50菌落(A)及孢子絲形態(tài)(B)Fig.2 Colony (A) and sporotrichial (B) of strain TC-50

圖3 基于16S rDNA序列分析的放線菌TC-50系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain TC-50 based on the sequence analysis of 16S rDNA

3 討 論

新疆地域廣闊，擁有多種特殊的自然環(huán)境，造就了該地區(qū)獨特的微生物資源及其特殊的代謝物。天山天池位于新疆塔里木盆地和準噶爾盆地天然分界線上，海拔1 928 m，年均氣溫2.5 ℃，冬季長期處于-15 ℃以下。本研究從該地區(qū)獲得213株放線菌，其中有24株耐4 ℃低溫的放線菌?？梢?，該地區(qū)的耐低溫放線菌較為豐富。另外，本研究發(fā)現(xiàn)草甸土中的放線菌數(shù)量(1.58×108CFU/g)顯著高于其他類型土壤中的放線菌。從王啟蘭等[15]的研究可見，青藏高原地區(qū)多種草甸土中平均放線菌數(shù)量顯著低于本研究結果，僅為5.676×104CFU/g，但是獲得的低溫放線菌數(shù)量占比較高，為32.35%，其原因可能是青藏高原地區(qū)海拔較高，氣溫較低，更適合低溫放線菌的生長。

本研究以立枯絲核菌和番茄灰霉病菌為指示菌株，對213株放線菌進行抑菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)17株放線菌具有一定抑菌活性，占比8.0%。筆者曾對青藏高原地區(qū)放線菌進行抑菌活性篩選，在279株放線菌中發(fā)現(xiàn)28株具有抑菌活性的放線菌(組織法活性測定結果大于60%)，占比10%[16]，這與本研究結果有一定差異，主要原因在于土樣來源的不同、供試病原菌差異及生物活性測定方法的不同。因此，對于天池放線菌的生物活性需要深入研究，可針對抑菌、殺蟲、除草、誘抗活性等方面進行廣泛篩選。

分子鑒定結果顯示，菌株TC-50與S.chumphonensis最近緣。S.chumphonensis最早是在海洋沉積物中分離得到的，它的氣生菌絲為白色至黃白色，能產生長鏈狀的非移動性孢子[17]，而且至今仍未有文獻報道該菌株具有抑菌活性，由此可見菌株TC-50與S.chumphonensis存在較大差異。后期將采用細胞壁成分分析、DNA雜交等技術進一步探究兩者之間的關系，并明確菌株TC-50的準確分類地位。