當(dāng)歸的亞高原區(qū)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)與生長(zhǎng)觀察

賈 貞, 李三相, 狄勝?gòu)?qiáng), 趙菲佚, 王順才

(1.天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，隴東南植物功能基因組學(xué)與應(yīng)用開發(fā)研究所， 甘肅天水 741000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山東泰安 271018)

當(dāng)歸[Angelicasinensis(Oliv.) Diels]為傘形科多年生草本植物，主產(chǎn)于甘肅東南部的岷縣等海拔為1 500～3 000 m的高寒陰濕地區(qū)[1]，云南等地有少量栽培，其中，以岷縣當(dāng)歸產(chǎn)量最多，質(zhì)量最好，為當(dāng)歸傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)[2]。成藥后當(dāng)歸干燥的根為常用中藥材，具有補(bǔ)血活血等功效，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，除了藥用價(jià)值外，當(dāng)歸還用于煲湯等食用領(lǐng)域，在中國(guó)當(dāng)歸栽培歷史長(zhǎng)達(dá)1 700多年[3]。當(dāng)歸生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，從育苗、成藥到種子生產(chǎn)，分3個(gè)階段共3 a時(shí)間完成，第1年育苗，6月中旬播種，10月中旬起苗儲(chǔ)藏；第2年成藥，清明前后移栽，秋末采挖；第3年種子生產(chǎn)，選擇長(zhǎng)勢(shì)好的成藥當(dāng)歸根不收挖，留作第3年繁種結(jié)籽，8月中下旬采收。成藥期部分當(dāng)歸抽薹開花而得不到具有藥用價(jià)值的根，此即當(dāng)歸的早薹，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)50%～90%[4-5]，極大影響當(dāng)歸的產(chǎn)量。當(dāng)歸適應(yīng)于高原低溫區(qū)生長(zhǎng)，海拔對(duì)當(dāng)歸早薹和長(zhǎng)勢(shì)均具有顯著影響，株高、葉片數(shù)和抽薹率與海拔和經(jīng)度均呈極顯著負(fù)相關(guān)，株高、葉片數(shù)和抽薹率均與海拔間存在顯著直線回歸關(guān)系，可見，海拔是影響當(dāng)歸長(zhǎng)勢(shì)和早薹的主要生態(tài)因子，高海拔區(qū)種植的當(dāng)歸抽薹率顯著降低，同時(shí)，偏低海拔區(qū)種植易于導(dǎo)致極低的產(chǎn)量[6]。朱國(guó)慶[7]對(duì)甘肅當(dāng)歸生態(tài)氣候及適生種植區(qū)的區(qū)劃分析顯示，岷縣、漳縣及渭源南部海拔2 200～2 400 m間的氣候冷涼陰濕半山區(qū)為最適宜種植區(qū)；臨洮、渭源南部淺山區(qū)，海拔2 100～2 200 m間溫涼濕潤(rùn)淺的高寒陰濕山區(qū)為適宜種植區(qū)；海拔2 000～2 100 m的岷縣沿洮河河壩區(qū)及隴西南部溫和濕潤(rùn)河谷山壩區(qū)、漳縣東部川區(qū)；漳縣、岷縣、渭源南部海拔2 500～2 600 m的寒涼極濕潤(rùn)高山區(qū)，為次適宜種植區(qū)；漳縣東部及岷縣沿洮河海拔1 900～2 000 m 的溫暖濕潤(rùn)川區(qū)，漳縣、岷縣及渭源南部海拔2 600～2 800 m的寒冷極濕潤(rùn)高山區(qū)，為可種植區(qū)；定西地區(qū)南部海拔<1 900 m或>2 800 m的地區(qū)，甘肅中部蘭州、白銀、臨夏和甘南等地(州、市)及定西地區(qū)北部地區(qū)為不宜種植區(qū)，當(dāng)歸在該區(qū)大部分地方仍能成活，但氣候條件及土壤質(zhì)地不適宜當(dāng)歸生長(zhǎng)，不宜種植，可見，當(dāng)歸的適宜種植區(qū)極為嚴(yán)苛。

獲取試驗(yàn)材料的難易對(duì)該物種的研究具有重要的意義，模式植物擬南芥、水稻等是常溫植物，其培養(yǎng)不受環(huán)境的限制，擬南芥的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方便，對(duì)擬南芥分子遺傳學(xué)研究功不可沒。因此，方便快捷地培養(yǎng)試驗(yàn)材料對(duì)一個(gè)物種的研究至關(guān)重要[8]，但適應(yīng)高原生境的藥用植物當(dāng)歸則沒有這么幸運(yùn)，自明末栽培以來，當(dāng)歸始終而且只能在高海拔低溫區(qū)栽培生長(zhǎng)，當(dāng)歸育種和栽培的目標(biāo)之一，是向偏低海拔區(qū)栽培引種，以擴(kuò)大種植面積。其次，當(dāng)歸的適應(yīng)特性極大限制了當(dāng)歸栽培范圍及亞高原低海拔區(qū)實(shí)驗(yàn)室研究材料的獲取，導(dǎo)致當(dāng)歸的實(shí)驗(yàn)室研究材料均取自當(dāng)歸產(chǎn)區(qū)岷縣、渭源和臨洮等地[9]，不僅困難大，且存在取材不準(zhǔn)、易受季節(jié)等的限制，給當(dāng)歸的實(shí)驗(yàn)室研究造成了極大不便，嚴(yán)重制約了當(dāng)歸的研究。本試驗(yàn)探索一種在亞高原區(qū)培養(yǎng)當(dāng)歸的方法，通過亞高原區(qū)室內(nèi)培養(yǎng)，解決當(dāng)歸研究取材易受季節(jié)和氣候性等的影響和限制的問題。試驗(yàn)使用當(dāng)歸種子、2 a生當(dāng)歸苗及成藥后的當(dāng)歸根，在氣溫較高的亞高原城市天水市(平均海拔1 100 m，東經(jīng)104°35′～106°44′，北緯34°05′～35°10′)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，探索通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)為當(dāng)歸研究供材的可行性，觀察實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中當(dāng)歸的生長(zhǎng)及對(duì)亞高原高溫的反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)在2015-2017年間進(jìn)行。試驗(yàn)所用當(dāng)歸種子獲自甘肅省定西市岷縣，帶至實(shí)驗(yàn)室4 ℃冷藏，當(dāng)歸苗和成藥當(dāng)歸宿根由岷縣藥農(nóng)提供。當(dāng)歸盆栽使用規(guī)格為A300×200的花盆(外口徑27 cm，內(nèi)口徑23 cm，高27 cm)，花盆購(gòu)自天水市花鳥市場(chǎng)，帶地墊托盤。使用銘睿牌(E27型)4U-105W白光/黃色節(jié)能燈、E27平裝式耐高溫陶瓷燈座、戶外懸掛防水燈罩遮光、正泰時(shí)控開關(guān)(KG316T)定時(shí)控制燈的開關(guān)和導(dǎo)線，1 m高鐵架用于改裝光照補(bǔ)光設(shè)施。在黑色塑料培養(yǎng)盤(寬30 cm，長(zhǎng)50 cm，高15 cm)育苗。

1.2 方 法

1.2.1 當(dāng)歸苗和宿根的冷藏 當(dāng)歸苗可在前一年11月或當(dāng)年3月帶至實(shí)驗(yàn)室，依邱黛玉等[10]的方法進(jìn)行苗的大小分類：用游標(biāo)卡尺測(cè)量苗頭下1 cm處的根直徑，按苗直徑大小分出直徑小于0.45 mm的小苗和直徑大于0.80 mm的大苗，保留沒有機(jī)械損傷和病害者使用，暫時(shí)不用的苗捆扎用標(biāo)簽標(biāo)示，用沒有污染的濕土，儲(chǔ)埋于合適大小的塑料盒內(nèi)，置冰箱-5 ℃冷儲(chǔ)，可用于當(dāng)年或次年盆栽。

1.2.2 土壤的處理與盆裝 盆栽所用土壤為多次栽培過大豆(Soybean)富含氮質(zhì)的優(yōu)質(zhì)土壤，經(jīng)砂網(wǎng)濾篩，搬至實(shí)驗(yàn)室，盛于大小合適的鐵桶，置高溫滅菌鍋滅菌10 min，取出放涼，備用。處理好的土壤用于裝盆，盆內(nèi)不宜太滿，與花盆邊緣約2～3 cm即可，盆底墊托盤上澆水。

1.2.3 栽苗 苗的栽植方法與產(chǎn)區(qū)藥農(nóng)栽植方法一致：用小鏟在盆內(nèi)土壤掏出適宜大小的坑，將苗豎直放入坑內(nèi)填土，苗頭不宜高出土面。每盆栽4～6窩，0.45 mm以下的小苗2株/穴，苗根直徑0.85 mm以上的大苗1株/穴，栽好后用保鮮膜覆蓋盆口，以保溫保濕，出苗后在膜上捅出部分小孔換氣、放苗。

1.2.4 培養(yǎng)當(dāng)歸生長(zhǎng)的光溫 利用戶外懸掛防水燈罩，配合E27型4U-105W白光和黃色節(jié)能燈(2個(gè)節(jié)能燈/燈罩)補(bǔ)光，燈高1.5 m(2燈/m2，1黃燈/2 m2)，光照時(shí)長(zhǎng)為16 h/d(4:00-20:00)。在室內(nèi)自然溫度下培養(yǎng)，反季節(jié)培養(yǎng)，借助室內(nèi)暖氣補(bǔ)溫。

1.2.5 當(dāng)歸的RNA提取 分別取育苗期苗的第3個(gè)蓮座葉、冬季培養(yǎng)成藥期、成籽期當(dāng)歸的薹頂節(jié)完全展開復(fù)葉，用Invitrogen公司的TRIZOL試劑(cat#：15596026)提取RNA。使用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑，體系如下，10 μL變性液：Oligo dT Primer (50 μmol/L) 1 μL、dNTP Mixture (10 mmol/L each) 1 μL、模板RNA Total RNA 3～4 μg、RNase free H2O 定容至10 μL，94 ℃ 10 min變性、冷卻。上述模板變性液、5×PrimeScript Ⅱ Buffer (4 μL)、PrimeScript Ⅱ RTase (200 U/μL) 1 μL、RNase Inhibitor (40 U/μL) 0.5 μL、無RNase H2O調(diào)節(jié)總體系至20 μL。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的驗(yàn)證和內(nèi)標(biāo)半定量使用當(dāng)歸肌動(dòng)蛋白基因actin，當(dāng)歸開花關(guān)鍵基因AsFTL(AngelicasinensisFlowering locus T-like)用以表達(dá)驗(yàn)證，其引物如下(表1)，55 ℃退火，內(nèi)標(biāo)基因Asactin的PCR擴(kuò)增調(diào)整至30個(gè)循環(huán)，AsFTL的PCR擴(kuò)增為25個(gè)循環(huán)。

栽植后每隔7 d進(jìn)行當(dāng)歸復(fù)葉葉片數(shù)的計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)整理使用Excel軟件，數(shù)據(jù)分析使用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[11]，用Origin 6.0軟件繪圖。

表1 開花基因表達(dá)檢測(cè)用引物及其序列Table 1 Agronomic traits of dormant medicine-forming Angelica roots induced by summer hot

2 結(jié)果與分析

2.1 當(dāng)歸的實(shí)驗(yàn)室育苗

當(dāng)歸的室內(nèi)育苗采用預(yù)先萌發(fā)，然后點(diǎn)播的方法。種子預(yù)先在培養(yǎng)皿中潤(rùn)濕(2017-04-01)，置室溫萌發(fā)12 d，萌發(fā)露白(圖1-A)。挑選萌發(fā)的種子點(diǎn)播至盛滿土的培養(yǎng)盤內(nèi)，株間距1～2 cm，保鮮膜覆蓋保濕，挑播的當(dāng)歸苗成活率接近100%，生長(zhǎng)良好，自萌發(fā)后60 d長(zhǎng)出2片真葉復(fù)葉，后緩慢增多，葉面積不斷增大，至 102 d時(shí)達(dá)3片復(fù)葉(圖1-B)。小噴壺隨時(shí)噴水以使土壤和苗始終處于潤(rùn)濕狀態(tài)，3～6月苗生長(zhǎng)良好。

2.2 成藥期當(dāng)歸的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)與生長(zhǎng)觀察

成藥期當(dāng)歸的培養(yǎng)每年分冬春季2個(gè)季節(jié)進(jìn)行，春季培養(yǎng)既可用-5 ℃冷儲(chǔ)當(dāng)歸苗，也可采用當(dāng)年從產(chǎn)區(qū)帶至實(shí)驗(yàn)室的苗盆栽， 9月反季節(jié)盆栽使用冰箱冷儲(chǔ)苗。

2.2.1 成藥期當(dāng)歸的春季培養(yǎng) 成藥期當(dāng)歸的春季培養(yǎng)與生長(zhǎng)：從4月開始，當(dāng)歸苗定期分2次盆栽，第1批4月9日盆栽，9 d后長(zhǎng)出1～2片復(fù)葉，此后，葉片數(shù)逐漸增多，葉面積逐漸增大， 14 d 時(shí)小苗當(dāng)歸的葉片長(zhǎng)度和葉面積明顯小于大苗當(dāng)歸(圖1-C)，生長(zhǎng)至48 d時(shí)，大苗當(dāng)歸出現(xiàn)抽薹(圖1-D)，此后，薹日漸增高，節(jié)數(shù)增多，至56 d時(shí)，薹上長(zhǎng)出飽滿的花序苞，當(dāng)歸的傘型花序即將進(jìn)入初花期(圖1-D 藍(lán)框)；未抽薹當(dāng)歸葉片數(shù)不斷增多，葉冠增大(圖1-E)。隨夏季氣溫的升高，栽苗后95 d時(shí)各類當(dāng)歸苗休眠(圖1-F)。從春季培養(yǎng)成藥當(dāng)歸的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)來看，盆栽75 d內(nèi)，始終保持良好的生長(zhǎng)勢(shì)頭，葉片數(shù)日漸增多，至熱休眠前，未抽薹當(dāng)歸最多可長(zhǎng)至8個(gè)復(fù)葉，晚2月的第2批盆栽苗，因高溫的脅迫，長(zhǎng)至3、4個(gè)葉片后即休眠(圖2-A)。

成藥期當(dāng)歸的熱休眠反應(yīng)：亞高原區(qū)當(dāng)歸的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)最難熬的是夏季高溫，6月前能正常生長(zhǎng)，6月底至7月初，待植株生長(zhǎng)至7、8個(gè)蓮座葉時(shí)，隨氣溫的升高，葉片逐漸變黃、枯萎，但根仍然存活，即進(jìn)入“夏休眠”狀態(tài)。分析顯示，休眠當(dāng)歸根的主根長(zhǎng)與早薹當(dāng)歸主根長(zhǎng)度間差異不顯著，早薹當(dāng)歸的主根直徑、側(cè)根數(shù)、鮮根質(zhì)量均顯著高于未早薹的當(dāng)歸(P<0.05)(圖1-F；表2)，可見，成藥當(dāng)歸的生長(zhǎng)早期，早薹植株活力旺盛，生長(zhǎng)能力強(qiáng)，形成較高的生物量，根和地上部分的一些性狀顯著高于未抽薹當(dāng)歸的相應(yīng)性狀，從二者地上部分的生長(zhǎng)上也可以觀察到這一現(xiàn)象。早薹當(dāng)歸抽薹進(jìn)入花期后，其根喪失了進(jìn)一步生長(zhǎng)的能力，但未抽薹當(dāng)歸的壯根生長(zhǎng)主要在秋季短日低溫下進(jìn)行，并形成強(qiáng)壯的藥用根。

2.1.2 成藥期當(dāng)歸的反季節(jié)培養(yǎng) 當(dāng)歸苗在岷縣按傳統(tǒng)方式貯存越冬，3月帶至實(shí)驗(yàn)室-5 ℃冷儲(chǔ)，于9月11日盆栽。成藥當(dāng)歸的越冬期反季節(jié)培養(yǎng)也獲得良好生長(zhǎng)，栽后65 d各類當(dāng)歸均處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)或營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)期(圖1-G)，栽苗后72 d大苗當(dāng)歸薹上第1節(jié)顯現(xiàn)，即進(jìn)入抽薹開花的生殖生長(zhǎng)期(圖1-G 藍(lán)框)。成藥當(dāng)歸的反季節(jié)培養(yǎng)中，110 d時(shí)未抽薹當(dāng)歸長(zhǎng)出7個(gè)蓮座葉。晚栽2月的同期第2批當(dāng)歸也能正常生長(zhǎng)，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)35 d內(nèi)長(zhǎng)出3個(gè)復(fù)葉。成藥期早薹當(dāng)歸長(zhǎng)出4～5個(gè)蓮座葉抽薹，該過程約需2個(gè)月，待完成抽薹約需110 d，此時(shí)，當(dāng)歸已長(zhǎng)至第7個(gè)蓮座葉，晚栽2月的當(dāng)歸，也能順利成長(zhǎng)，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，1月內(nèi)長(zhǎng)出3個(gè)蓮座葉(圖2-B)?？梢?，無論早薹或未抽薹的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間，均顯著長(zhǎng)于成藥當(dāng)歸春季培養(yǎng)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間，這可能與冬季氣溫較低有關(guān)。

2.3 成籽期當(dāng)歸的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)與結(jié)籽

收挖2 a生當(dāng)歸的成藥根， 在10月底當(dāng)歸成藥根的收挖期，挑選根體積小、未受蟲害或機(jī)械損傷的根，帶至實(shí)驗(yàn)室，置冰箱-5 ℃冷藏，次年9月取出反季節(jié)盆栽。成籽期當(dāng)歸的培養(yǎng)在春季和越冬期各進(jìn)行1次，春季培養(yǎng)在3月18日栽，反季節(jié)培養(yǎng)中，2 a生當(dāng)歸成藥根經(jīng)約1 a的凍儲(chǔ)，次年9月初取出冷凍室置4 ℃冷藏萌芽，于2016-09-23盆栽，盆栽時(shí)2 a生當(dāng)歸的根仍然保持良好的存活狀態(tài)，僅個(gè)別根毛處現(xiàn)少量白色發(fā)霉(圖1-H)。成籽期當(dāng)歸的生長(zhǎng)速度較快，栽后20 d已長(zhǎng)出4片復(fù)葉，第4片復(fù)葉是后來薹上的第1復(fù)葉，栽后37 d出現(xiàn)薹上的第1節(jié)(圖1-I，圖3)，栽后124 d長(zhǎng)成完整結(jié)籽當(dāng)歸傘型花序，籽粒生長(zhǎng)發(fā)育良好。成籽期當(dāng)歸栽后40 d完成主薹上全部葉片的生長(zhǎng)，其中3個(gè)蓮座葉、薹上3個(gè)主莖節(jié)及上端主莖節(jié)均可長(zhǎng)出側(cè)枝，形成側(cè)生傘型花序(圖1-J，圖3)，成籽當(dāng)歸生長(zhǎng)后期開花結(jié)籽較慢，成籽約需要130 d。春季培養(yǎng)和反季節(jié)培養(yǎng)生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)相似(圖3)，春季培養(yǎng)中因后期的夏季高溫，難以形成有效的種子。在冬季反季節(jié)培養(yǎng)中，足夠的低溫和時(shí)間足以完成種子的生長(zhǎng)成熟。

A-B. 當(dāng)歸的育苗 Photos ofAngelicaseedling;A.當(dāng)歸種子的萌發(fā)(4月13日) Germination ofAngelicaseeds cultured on dish for 12 d (April 13th shoot)； B.培育102 d的當(dāng)歸苗(7月12日)，白框內(nèi)為相應(yīng)時(shí)期的放大Angelicaseedlings cultured for 102 d (July 12), it is enlarged in the white frame；C-G.期當(dāng)歸的成藥培養(yǎng)(2016-04-09栽) Photo series of medicine-formingAngelica(planted on April 9, 2016);C.栽苗后14 d(4月23日)，黃色三角指示當(dāng)歸苗類的大小 YoungAngelicaat 14 d AP (April 23)，yellow triangle indicates the size ofAngelicaseedlings;D.栽后48 d的抽薹苗(5月27日) Bolt appeared on 48 d AP(May 27)；白框內(nèi)為抽薹當(dāng)歸后期形成的由花序鞘包裹的花序苞 The inflorescence at 65 d AP is shown in the frame of the earliest boltingAngelicabefore flower open；E. 栽苗后56 d的未抽薹營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)當(dāng)歸(6月4日) The vegetativeAngelicaat 56 d AP (June 4th)；F. 休眠當(dāng)歸的收挖根 The harvested roots of the dormantAngelica：1、2為未抽薹營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)當(dāng)歸的根 1, 2 are the vegetative roots，3、4為早薹當(dāng)歸的根 3, 4 are the boltedAngelicaroots;G. 栽苗后72 d的冬季反季節(jié)培養(yǎng)未抽薹營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)當(dāng)歸(2016-09-11栽，11月22日拍照) VegetativeAngelica(planted on September 11, 2016) cultured in winter season at 65 d AP (November 22)；白框內(nèi)為栽后65 d的早薹當(dāng)歸(11月6日拍照)，黃色箭頭所指為首節(jié) The boltingAngelicaat 72 d AP (November 6) is shown in the frame；the yellow arrow points to the first nod in bolt；H-J.3 a生成籽期當(dāng)歸的成籽培養(yǎng) Photographs of triennialAngelicain winter growth;H. 經(jīng)冬儲(chǔ)的2 a生成藥當(dāng)歸根(2016-09-23) BiennialAngelicaroot overwintered ice box storage (September 23, 2016)；a. 1 a生當(dāng)歸小苗 Small seedlings are for medicine-forming growth;b.1 a生當(dāng)歸大苗 Bigger seedlings are for medicine-forming growth;c. 2 a生成藥當(dāng)歸根 Biennial root seedlings are for reproductive growth for seeds;I. 栽后20 d(2016-10-12) TriennialAngelicaat 20 d after plantation (October 12, 2016);白框內(nèi)為栽后37 d出現(xiàn)的首節(jié)(2016-10-28) TriennialAngelicaat 37 d AP, and the first nod of bolt appears (October 28, 2016);J.栽后124 d的成籽期當(dāng)歸(2017-01-24拍照)，白框?yàn)榛ㄐ虻姆糯?TriennialAngelicaat 124 d AP (January 24, 2017), the amplified inflorescence is shown by the white frame;AP.after plantation

圖1 育苗、成藥和成籽期培養(yǎng)當(dāng)歸的生長(zhǎng)發(fā)育Fig.1 Cultured Angelica at seedling, medicine-forming and seed-producing stages

注：苗于2016-03-18盆栽，7月3日熱休眠收挖。數(shù)值為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”。

Note:Seedlings were potted on March 18, 2016, and the roots were collected on July 3.Value of seedlings was “mean±SE”.

A. 春季培養(yǎng)，分別栽于4月9日、6月9日 In spring culture, the seedlings was transplanted on April 9 and June 9,respectively；B. 反季節(jié)培養(yǎng)，分別栽于9月11日、11月11日 In overwintering culture, the seedlings was transplanted on September 11 and November 11 respectively；各值為3盆共15株苗的“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤” The mean was more than 15 seedlings in 3 pots,“mean±SE”

圖2實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)成藥期當(dāng)歸的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)
Fig.2Growthdynamicsofculturedmedicine-formingAngelica

各值為3盆共6個(gè)植株的“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤” Mean was more than 6 seedlings in 3 pots “mean±SE”

圖32a生成籽期當(dāng)歸的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)
Fig.3GrowthdynamicsofAngelicaforseedsinthethirdyear

2.4 當(dāng)歸AsFTL基因表達(dá)的RT-PCR半定量檢測(cè)驗(yàn)證

取育苗期完全展開的第3復(fù)葉、冬季培養(yǎng)成藥期和成籽期當(dāng)歸薹頂節(jié)上完全展開的復(fù)葉，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后做當(dāng)歸重要開花基因AsFTL(GenBank: MF795555)表達(dá)的RT-PCR半定量。結(jié)果顯示，在各時(shí)期當(dāng)歸葉片內(nèi)參基因Asactin亮度接近的情況下，育苗期的當(dāng)歸葉片內(nèi)AsFTL極為微弱或檢測(cè)不到，但在成藥期早薹和成籽期當(dāng)歸的葉片中，AsFTL的表達(dá)量較高，二者表達(dá)量接近(圖4)，顯示，AsFTL的表達(dá)與當(dāng)歸抽薹開花有關(guān)。

圖4 當(dāng)歸葉片AsFTL表達(dá)的RT-PCR半定量檢測(cè)Fig.4 RT-PCR semi-quantitative detection of AsFTL expression in leaves of Angelica

3 討論與結(jié)論

在道地產(chǎn)區(qū)，當(dāng)歸種子于夏至播種于海拔約3 000 m以上的生荒地，本研究在亞高原區(qū)實(shí)驗(yàn)室于4月進(jìn)行播種育苗，從種子萌發(fā)到苗的生長(zhǎng)，在6月前氣溫低，苗的生長(zhǎng)良好，但隨夏季氣溫的升高，苗面臨高溫脅迫，這種情況下，若能輔佐以空調(diào)降溫則可維持苗的生長(zhǎng)。當(dāng)歸的反季節(jié)育苗已有較大進(jìn)展[12]，實(shí)驗(yàn)室同樣可進(jìn)行當(dāng)歸的反季節(jié)育苗。研究中當(dāng)歸的春、冬季成藥培養(yǎng)均能正常生長(zhǎng)，遵循大苗抽薹小苗營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的常規(guī)現(xiàn)象，但春季培養(yǎng)因氣溫高而生長(zhǎng)快。陽坡、低海拔高溫[5，10]下栽培易導(dǎo)致當(dāng)歸早薹，因此，對(duì)當(dāng)歸來說上述高溫是一種逆境，在該逆境下，當(dāng)歸以早薹開花結(jié)籽的方式縮短生活史，以回避逆境[13]，是植物對(duì)高溫脅迫的逃逆反應(yīng)[14]。本研究中未早薹當(dāng)歸則進(jìn)入夏休眠狀態(tài)，說明，當(dāng)歸的高溫反應(yīng)除早薹開花外，未能抽薹的小苗當(dāng)歸的高溫反應(yīng)則是休眠。溫度是誘導(dǎo)植物開花的一個(gè)因子[15-16]，通過溫度調(diào)控途徑實(shí)現(xiàn)[17]。在適度高溫誘導(dǎo)下，具有早薹潛力的大苗當(dāng)歸進(jìn)入抽薹開花和結(jié)籽等生殖活動(dòng)以保存后代，而沒有早薹潛能的小苗當(dāng)歸則仍維持營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，在更高的溫度下，這些當(dāng)歸因不能持續(xù)生長(zhǎng)而休眠。因此，筆者認(rèn)為早薹是當(dāng)歸對(duì)適度高溫的反應(yīng)，而在更高溫度下，則發(fā)生當(dāng)歸根的休眠，但后者僅限于未抽薹的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)當(dāng)歸。夏休眠的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)由活躍期向停滯期的轉(zhuǎn)變涉及重大的發(fā)育變化，如休眠再生芽的形成、分生組織活動(dòng)的停止，導(dǎo)致葉發(fā)生的停止及隨后地上部分的衰老以及代謝向儲(chǔ)藏器官的再轉(zhuǎn)移[18]，長(zhǎng)日高溫是一些植物夏休眠的誘因[19]，ABA可能參與這一過程[20]。當(dāng)歸的早薹或高溫下休眠反應(yīng)限制了當(dāng)歸的有效栽培范圍，隨全球氣溫的變暖[21]，當(dāng)歸的種植范圍不僅難于擴(kuò)大，縮小也在情理之中[22]。由此，當(dāng)歸可在亞高原區(qū)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，在面對(duì)夏季高溫會(huì)做出逃逸反應(yīng)，但當(dāng)歸的越冬反季節(jié)培養(yǎng)則不存在這一問題。本研究中當(dāng)歸的育苗和成藥培養(yǎng)自4月開始，與道地產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸的成藥栽植同步，但依亞高原區(qū)的氣溫，當(dāng)歸的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)完全可提前至2月3月進(jìn)行，最晚可在5月進(jìn)行，冬季反季節(jié)培養(yǎng)待氣溫轉(zhuǎn)涼的9月初即可進(jìn)行。3 a生成籽期當(dāng)歸根的收集盡可能選用最小的根，以減少儲(chǔ)藏空間。FT(Flowering Locus T)及其同源基因是植物開花調(diào)控途徑的重要整合因子和調(diào)控開花的關(guān)鍵基因之一[23]，已被證實(shí)是擬南芥等多種植物可傳導(dǎo)開花物質(zhì)“成花素”的編碼基因[24]。FT的同源基因的表達(dá)可縮短蘋果和柑橘等多年生植物的成花年限[25-26]。當(dāng)歸AsFT基因(AngelicasinensisFlowering Locus T)及其同源基因AsFTL是當(dāng)歸早薹開花的關(guān)鍵基因。本研究中通過檢測(cè)不同發(fā)育階段當(dāng)歸葉片AsFTL的表達(dá)，以驗(yàn)證培養(yǎng)當(dāng)歸做為試驗(yàn)材料的可行性。半定量RT-PCR分析顯示，育苗期當(dāng)歸中沒有AsFTL的表達(dá)，而在成藥期早薹當(dāng)歸和成籽期當(dāng)歸葉片中存在強(qiáng)烈表達(dá)，這與其他植物FTL同源基因及筆者關(guān)于當(dāng)歸早薹相關(guān)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致，說明亞高原實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的當(dāng)歸可用于其基因表達(dá)研究。

溫度、光照和土壤是影響當(dāng)歸室內(nèi)培養(yǎng)的主要因素。(1)溫度：當(dāng)歸生長(zhǎng)對(duì)低溫有很強(qiáng)的依賴性，道地產(chǎn)區(qū)岷縣及周邊平均海拔為2 200～2 400 mm[27]，對(duì)比岷縣和天水市秦州區(qū)氣溫變化，天水市秦州區(qū)7月、8月白天氣溫可超過30 ℃，達(dá)35 ℃，夜間最低氣溫也在20 ℃左右，晝夜溫差小，此時(shí)岷縣白天最高氣溫接近或偶爾高于30 ℃，夜間氣溫可低至15 ℃以下，晝夜溫差大，而大田實(shí)際溫度更低，是適合當(dāng)歸生長(zhǎng)的溫周期。溫周期通過調(diào)節(jié)植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素改變植株晝夜間硝酸還原酶的表達(dá)和活性的循環(huán)模式[28]，對(duì)植物的種子萌發(fā)[29]等生長(zhǎng)發(fā)育具有十分重要的意義。當(dāng)歸的實(shí)驗(yàn)室春季培養(yǎng)符合當(dāng)歸的溫周期，白天氣溫高，當(dāng)歸生長(zhǎng)快，而反季節(jié)培養(yǎng)因依賴于室內(nèi)暖氣，夜間溫度較高，不符合當(dāng)歸的溫周期，但也能正常生長(zhǎng)，若能在夜間輔以空調(diào)等降溫設(shè)施則更符合當(dāng)歸的生長(zhǎng)特性。(2)土壤：當(dāng)歸是大田作物，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，成籽期當(dāng)歸具有碩大的根，盆栽培養(yǎng)盆不宜太小，蛭石等基質(zhì)也不適于當(dāng)歸的培養(yǎng)，否則會(huì)造成后期營(yíng)養(yǎng)缺乏。當(dāng)歸的盆栽培養(yǎng)只能使用土壤，產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸的栽培以肥沃、土層深厚的黑土或褐土類、質(zhì)地疏松及排水良好的肥沃富含腐殖質(zhì)的砂質(zhì)土壤為佳，不宜在易板結(jié)的粘土和貧瘠的砂質(zhì)土上栽種[7,30]。本研究中當(dāng)歸培養(yǎng)所用土壤為經(jīng)多次栽培大豆(Glycinemax(L.) Merr)的黑色土壤。當(dāng)歸的根極易受土壤微生物的污染和蟲害而腐爛，因此，土壤用前需經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌10 min，以殺死土壤內(nèi)的線蟲等爬蟲類害蟲和雜草類，減免對(duì)根苗的污染和苗期蟲害，保證苗的健康生長(zhǎng)，也可除去草籽消除雜草，保證盆內(nèi)清潔。產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸的育苗在“生荒地”進(jìn)行，同地塊經(jīng)歷一兩次育苗后，10 a后方可進(jìn)行下次育苗。本研究中當(dāng)歸的育苗使用與盆栽相同的普通土壤，亦能獲得正常的生長(zhǎng)苗。(3)光照：本研究中當(dāng)歸的培養(yǎng)通過節(jié)能燈補(bǔ)光，光照度為2 000～3 000 lx，完全滿足當(dāng)歸的生長(zhǎng)，光照的時(shí)長(zhǎng)依試驗(yàn)需要設(shè)置，本研究使用16 h的長(zhǎng)日光照，旨在促進(jìn)當(dāng)歸生長(zhǎng)和早薹。當(dāng)歸的室內(nèi)培養(yǎng)平時(shí)還應(yīng)注意苗期管理，當(dāng)歸性喜涼爽和濕潤(rùn)的環(huán)境，在空氣濕度較大的環(huán)境下生長(zhǎng)良好，因此，依盆內(nèi)土壤干濕程度適時(shí)澆水，使土壤始終處于濕潤(rùn)狀態(tài)。為防止盆面上澆水形成板結(jié)，采用在盆墊托盤上澆水的方法，每次澆水加滿托盤。當(dāng)歸培養(yǎng)期間可用小噴霧器在植株地上部噴霧，以緩解環(huán)境氣溫的升高和保濕。