哺乳幼獐大腸桿菌和松鼠葡萄球菌混合感染的 病原鑒定及診治初報

徐海軍，左瑞華，張圣堯，楊先保，王廣林

(1.皖西學(xué)院 健康養(yǎng)殖與動物疫病監(jiān)測預(yù)警工程技術(shù)中心，安徽六安 237012；2.安徽金豐源畜牧科技有限公司， 安徽六安 237010；3.皖西學(xué)院 分析測試中心，安徽六安 237012)

獐，又名河麂、牙獐，是哺乳綱偶蹄目鹿科的一種小型鹿類，主要分布于長江中下游和東南沿海各省，現(xiàn)存數(shù)量不多，為中國二類保護(hù)野生動物。獐的皮、骨、肉都有很高的食用和藥用價值。幼獐吮吸的母乳在胃中結(jié)積的奶塊(民間俗稱“獐寶”)，是數(shù)百年來在江浙太湖流域民間廣泛應(yīng)用的名貴藥材，主治小兒疳積等消化不良癥，功效顯著[1-2]。目前在中國已有少量養(yǎng)獐場，養(yǎng)殖效益較好[3-4]。由于獐的人工馴養(yǎng)時間較短，對獐的一些疾病還認(rèn)識不足，嚴(yán)重影響?zhàn)B獐業(yè)的健康發(fā)展。本文報告一例哺乳幼獐大腸桿菌和松鼠葡萄球菌混合感染的病原鑒定及診治過程，供相關(guān)人員參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥品

胰大豆蛋白胨瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，細(xì)菌藥敏試紙購自杭州微生物試劑有限公司，革蘭氏染色液購自杭州天和微生物試劑有限公司，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌檢測卡購自法國梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，頭孢曲松鈉購自齊魯安替制藥有限公司，白龍散購自河南超牧獸藥有限公司。

1.2 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器 (上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，SW- CJ- RD 雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，STT-P-A系列智能生化培養(yǎng)箱(合肥華德利科學(xué)器材有限公司)，DGT-G系列電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(合肥華德利科學(xué)器材有限公司)，VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀(法國梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司)：電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 病例來源

六安市某養(yǎng)獐場發(fā)病幼獐。

1.4 方 法

1.4.1 病史調(diào)查 2018-06-13六安市羅集鄉(xiāng)某養(yǎng)獐戶送檢2只哺乳幼獐(1只死亡，1只存活)。通過詢問養(yǎng)殖戶，對整個發(fā)病過程進(jìn)行調(diào)查。

1.4.2 臨床癥狀和病理解剖觀察 觀察送檢活獐的臨床癥狀。剖檢送檢的死獐，觀察病變。

1.4.3 細(xì)菌分離、鑒定及藥敏試驗 剖檢時無菌采集 2 只幼獐的肺臟和肝臟組織，涂擦接種于胰大豆蛋白胨瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18 h。對分離菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并用VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀細(xì)菌學(xué)專家系統(tǒng)鑒定，然后進(jìn)行藥敏試驗。

1.4.4 防治措施 根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇敏感藥物對病獐進(jìn)行治療，對同窩幼獐進(jìn)行預(yù)防性給藥。在母獐飼料里添加白龍散進(jìn)行預(yù)防。同時做好消毒工作，保持飼養(yǎng)場所衛(wèi)生良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 病史調(diào)查

經(jīng)了解，該養(yǎng)殖場共存欄大小獐100多只，采用自繁自養(yǎng)養(yǎng)殖方式。近期有 2 窩幼獐陸續(xù)發(fā)病，癥狀主要表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉(但也有個別獐未見腹瀉)、腿無力癱軟、側(cè)臥在地，常抽搐。按照鄉(xiāng)村獸醫(yī)的建議給2 頭病獐肌注恩諾沙星進(jìn)行治療，但注射恩諾沙星后不久1 頭幼獐死亡，另1 頭幼獐病情沒有好轉(zhuǎn)，遂帶來送檢。次日又出現(xiàn)2 頭幼獐發(fā)病。發(fā)病幼獐還未斷奶，但給其哺乳的母獐均無發(fā)病。

2.2 臨床癥狀和病理剖檢

送檢死獐的主要病變?yōu)樾膬?nèi)膜有一小出血斑；肺部有數(shù)個散在小出血斑，直徑約1 mm。其他未見明顯異常。因為每只幼獐價值4 000元以上，比較貴重，所以對另1 只存活的幼獐沒有立即剖檢，而是采用靜脈滴注葡萄糖酸鈣(曾懷疑可能患有缺鈣)、50 g/L葡萄糖生理鹽水、胃復(fù)安、西米替丁、地塞米松和頭孢曲松鈉進(jìn)行搶救。但次日早上，該只幼獐仍然死亡。死前體溫降低，并多次出現(xiàn)角弓反張樣神經(jīng)癥狀(圖1)。對其進(jìn)行剖檢，但未觀察到明顯病變。

2.3 細(xì)菌分離、鑒定及藥敏試驗

從第1只幼獐的肺臟和肝臟分離到較多細(xì)菌，且從肺臟中分離到的細(xì)菌數(shù)量明顯多于肝臟(圖2)，經(jīng)涂片染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，肝臟組織和肺臟組織中分離到的細(xì)菌形態(tài)相同，且藥敏試驗結(jié)果相似(圖3)，說明從2種組織中分離到的細(xì)菌為同一種細(xì)菌；第2只幼獐肝臟組織接種區(qū)在培養(yǎng)18 h 后僅長出2個灰白色菌落，與從第1只幼獐2種組織中分離細(xì)菌的菌落、菌體形態(tài)一致，但肺臟組織接種區(qū)在培養(yǎng)18 h后只長出較多細(xì)小菌落(圖4)，延長培養(yǎng)時間至42 h后菌落才較大。

圖2 從第1只幼獐肝臟組織和肺臟組織 中分離到的細(xì)菌(37 ℃培養(yǎng)18 h)Fig.2 Bacteria isolated from liver and lung tissue of first young Chinese water deer(37 ℃, 18 h)

菌.頭孢曲松 Ceftriaxone；丁.丁胺卡那 Amikacin；多.粘桿菌素 Colistin；恩.恩諾沙星 Enrofloxacin；強(qiáng).強(qiáng)力霉素 Doxycycline ；尼.氟苯尼考 Florfenicol

圖3從第1只幼獐肝臟組織和肺臟組織中分離到的細(xì)菌的藥敏試驗結(jié)果
Fig.3ResultsofdrugsensitivitytestofbacteriaisolatedfromliverandlungtissueoffirstyoungChinesewaterdeer

因此，從第1頭獐和第2頭獐上分別分離到1種和2種細(xì)菌。將第1頭獐肺臟、肝臟和第2頭獐肝臟組織中分離到的細(xì)菌命名為細(xì)菌1，將第2頭獐肺臟組織中分離到的細(xì)菌命名為細(xì)菌2。2種細(xì)菌傳代培養(yǎng)后菌落形態(tài)相似，為圓形、邊緣整齊、隆起、表面光滑濕潤、不透明、灰白色，但細(xì)菌2的菌落在培養(yǎng)時間延長后變?yōu)闇\黃色。2種細(xì)菌分別制成細(xì)菌涂片，革蘭氏染色后鏡檢，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌1為革蘭氏陰性短桿菌(圖5)，細(xì)菌2為革蘭氏陽性球菌(圖6)。

使用革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌生化鑒定卡，用VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀細(xì)菌學(xué)專家系統(tǒng)鑒定，根據(jù)細(xì)菌64 種生化反應(yīng)結(jié)果，并結(jié)合細(xì)菌革蘭氏染色特點，細(xì)菌1被鑒定為大腸桿菌(鑒定正確率為99 %)，細(xì)菌2被鑒定為松鼠葡萄球菌(鑒定正確率為97%)。藥敏試驗結(jié)果顯示細(xì)菌1對頭孢曲松和丁胺卡那中敏，對恩諾沙星、粘桿菌素低敏，對氟苯尼考、強(qiáng)力霉素耐藥；細(xì)菌2對磷霉素和頭孢曲松高敏，對恩諾沙星、丁胺卡那中敏，對粘桿菌素低敏，對強(qiáng)力霉素和氟苯尼考耐藥(圖7)。

圖4 從第2只幼獐肺臟組織中分離到的 細(xì)菌培養(yǎng)菌落(37 ℃培養(yǎng)18 h)Fig.4 Bacterial isolated from lung tissue of second young Chinese water deer (37 ℃ 18 h )

圖5 鑒定出的大腸桿菌革 蘭氏染色結(jié)果(1 000×)Fig.5 Gram staining result of identified Escherichia coli (1 000×)

圖6 鑒定出的松鼠葡萄球菌 革蘭氏染色結(jié)果(1 000×)Fig.6 Gram staining result of identified Staphylococcus sciuri (1 000×)

磷.磷霉素 Antibacterial drugs；其他同圖3 The same as ones used in Fig.3 besides fosfomycin

圖7從第2只幼獐肺臟組織中分離到的細(xì)菌藥敏試驗結(jié)果
Fig.7ResultofdrugsensitivitytestofbacteriaisolatedfromlungtissueofsecondyoungChinesewaterdeer

2.4 診治措施及效果

由于幼獐還在哺乳期，不方便全群口服給藥，所以根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，建議養(yǎng)殖戶對同窩其他未發(fā)病幼獐采用頭孢曲松鈉(按體質(zhì)量20 mg/kg，每日2次)連續(xù)肌注3 d進(jìn)行預(yù)防，母獐飼料中添加白龍散(主要成分為白頭翁、龍膽、黃連)，同時做好圈舍消毒。對已發(fā)病幼獐隔離治療，人工喂牛奶，肌注頭孢曲松鈉(按體質(zhì)量20 mg/kg，每日2次)，并灌服白龍散煎劑，連用4 d。1周后回訪得知，病情已得到控制，2頭病獐經(jīng)治療后康復(fù)，未再出現(xiàn)新發(fā)病例。此次疫情累計發(fā)病4頭，死亡2頭，治愈2頭。

3 討 論

獐是一種馴養(yǎng)時間較短的動物，目前對其一些疾病特點還認(rèn)識不足。本病例中，獐的病情較為嚴(yán)重，發(fā)病幼獐表現(xiàn)腿腳癱軟，無法站立，非常虛弱，且常有抽搐癥狀，但剖檢病變卻非常輕微，甚至觀察不到明顯病變。然而細(xì)菌分離時卻又分離到較多細(xì)菌，說明體內(nèi)細(xì)菌感染較為嚴(yán)重。第2只獐由于進(jìn)行頭孢曲松鈉靜脈滴注治療，所以初次分離時從肺臟分離到的松鼠葡萄球菌在培養(yǎng)18 h時菌落非常細(xì)小，直至42 h菌落才較大?？赡苁求w內(nèi)殘留的頭孢曲松鈉對該菌生長起到一定的抑制作用。分離到的松鼠葡萄球菌在傳代培養(yǎng)時生長速度恢復(fù)正常。但從第2只獐肝臟中分離到的大腸桿菌在分離培養(yǎng)18 h就長成較大菌落，可能是因為它對頭孢曲松鈉的敏感性低于松鼠葡萄球菌，藥敏試驗結(jié)果證實這一推測。細(xì)菌分離結(jié)果還表明2種細(xì)菌在肺臟和肝臟中的分布存在較大差異。例如，第1只獐的肺臟中細(xì)菌數(shù)量大大高于肝臟中的數(shù)量；從第2只獐的肺臟中沒有分離到大腸桿菌，但有較多松鼠葡萄球菌，而從肝臟中只分離到2個大腸桿菌，但沒有分離到松鼠葡萄球菌。另一個值得注意的現(xiàn)象是給病獐哺乳的母獐均未發(fā)病，說明母獐對本病有較強(qiáng)抵抗力或這2種菌的感染能力不強(qiáng)。有待進(jìn)一步探討的是，細(xì)菌感染和臨床癥狀如此嚴(yán)重卻沒有導(dǎo)致臟器出現(xiàn)嚴(yán)重的病理變化(如臟器出血、壞死等)。

VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀鑒定系統(tǒng)是根據(jù)細(xì)菌的生化代謝特點進(jìn)行菌種鑒定，準(zhǔn)確率和重復(fù)性極高,非常適合臨床快速、準(zhǔn)確鑒定病原菌[5-6]。因此，本病例中的細(xì)菌鑒定結(jié)果比較可靠。大腸桿菌是一種常見的病原菌，在其他動物上(如仔豬等)也經(jīng)常引起腹瀉。所以本病例中的腹瀉癥狀可能也是大腸桿菌引起的。松鼠葡萄球菌是一種環(huán)境性病原菌，在環(huán)境中廣泛存在，該菌可感染多種動物，如魚類[7]、龜[8]、竹鼠[9]、人[10-11]。該菌也是仔豬滲出性皮炎的病原之一[12-13]。本病例中第1頭獐只感染大腸桿菌，但第2頭獐同時感染大腸桿菌和松鼠葡萄球菌，這可能也是導(dǎo)致發(fā)病獐臨床癥狀不完全相同的原因之一。據(jù)養(yǎng)殖戶介紹，哺乳幼獐一般在40日齡斷奶，但在14日齡時就表現(xiàn)出嘗試吃少量草料的行為。而這次發(fā)病獐的日齡恰好是15～16日齡。因此，這次發(fā)病可能是因為幼獐吃一些沒清理干凈的不新鮮草料或糞便，從而引起細(xì)菌感染。以往養(yǎng)殖戶在這個階段會在哺乳母獐飼料中添加白龍散來預(yù)防母獐和幼獐發(fā)病。今年因為沒有及時買到白龍散，就忽視預(yù)防。

4 結(jié) 論

通過細(xì)菌分離和鑒定，該養(yǎng)獐場幼獐發(fā)病原因確認(rèn)為大腸桿菌和松鼠葡萄球菌混合感染。本病例在臨床癥狀和病理變化上具有非特異性，單純依據(jù)臨床癥狀和病理變化難以做出準(zhǔn)確診斷。因此，本病例的病原分離鑒定及診療過程對相關(guān)人員今后診治此病具有一定參考價值。